生物技术通报

李聪;郭天麒;梁小红;王英博;韩烈保;

2011, 0(04): 1-6.

摘要 ( 89 )

PDF (269KB) ( 492 )

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Ethylene responsive factors(ERFs)是植物中特有的一类重要的转录因子。ERFs转录因子含有一段高度保守的DNA结合区域,被称之为ERF区域。ERFs类转录因子可以直接与GCC-box等启动子结合,从而转录激活功能基因的表达,调节植株的抗性应答。它们参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁迫相关的应答过程,并且在水杨酸和脱落酸和茉莉酸信号转导途径中发挥一定的作用,调控植物多个信号转导途径。现针对ERFs类转录因子在植物逆境胁迫中的研究进展进行讨论。

植物DREB转录因子与植物激素的相互作用

王怡杰;韩烈保;

2011, 0(04): 7-15.

摘要 ( 115 )

PDF (363KB) ( 453 )

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DREB是植物中重要的转录因子,调控一系列非生物胁迫相关基因的表达,增强植物抵抗环境胁迫的能力。同时,当植物受到逆境胁迫时,植物体内的酶和激素都会发生变化,从而影响一系列的生理活动或生化变化来产生抵御胁迫的适应能力。近些年来,研究者们发现DREB与植物激素之间关系密切,从植物激素角度入手研究DREB的功能逐渐成为热点。就逆境胁迫下DREB转录因子与激素之间的相互作用进行阐述。

植物非生物胁迫诱导启动子顺式元件及转录因子研究进展

郭晋艳;郑晓瑜;邹翠霞;李秋莉;

2011, 0(04): 16-20.

摘要 ( 376 )

PDF (292KB) ( 1952 )

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顺式作用元件(cis-acting element)是与结构基因串联的特定DNA序列,是转录因子的结合位点,它们通过与转录因子结合调控基因转录的精确起始和转录效率,在植物基因表达调控过程中起着重要的作用。非生物胁迫诱导基因的表达受其上游启动子顺式作用元件及转录因子的调控,目前已发现了多种与非生物胁迫相关的顺势作用元件及转录因子,如DRE元件及DREB类转录因子、MYB元件及MYB类转录因子、GT-1元件及GT-1类转录因子等。顺式作用元件及转录因子的研究对研究植物非生物胁迫相关基因的表达调控具有重要意义,综述植物非生物胁迫诱导启动子功能元件及转录因子的研究进展。

植物microRNAs在植物发育和非生物胁迫响应中的作用

鲁晓燕;岳英;樊新民;马兵钢;赵宝龙;张虎平;

2011, 0(04): 21-25.

摘要 ( 106 )

PDF (242KB) ( 624 )

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microRNAs(miRNAs)是一类内源的长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA,其通过对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制调节mRNA的表达,在植物中起到重要的作用。主要介绍了植物miRNAs的特征、合成和作用机制,综述了miRNAs在植物生长发育和非生物胁迫响应中的作用。

精氨酸激酶蛋白及分子生物学的研究进展

苏晓峰;陆国清;程红梅;

2011, 0(04): 26-30.

摘要 ( 160 )

PDF (232KB) ( 799 )

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在无脊椎动物体内,精氨酸激酶(arginine kinase)在能量代谢过程中发挥着重要的作用。随着研究的深入,越来越多的数据表明,精氨酸激酶的作用不仅限于提供和维持能量的平衡,而且对生命活动的调控起到重要作用。综述无脊椎动物体内精氨酸激酶的进化历程、蛋白特性、特异表达及生物学功能等方面的研究进展,为深入研究无脊椎动物的抗性调控机制提供必要的参考。此外,对无脊椎动物精氨酸激酶的重要性和研究中存在的问题进行讨论。

紫苏种子脂肪酸组成及合成代谢研究进展

王计平;史华平;李润植;

2011, 0(04): 31-34.

摘要 ( 99 )

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紫苏是一种新型油料作物,种子含油量为35%左右,紫苏籽油脂肪酸组成丰富,含有棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)和α-亚麻酸(18∶3)等,其中α-亚麻酸(ALA)含量高达60%,广泛用于功能性保健食品、药物及油脂化工业。介绍紫苏种子脂肪酸组成及合成代谢基本途径,对近年来脂肪酸合成代谢基因工程研究进行概述与展望。

脂肪酶的特异性折叠酶

程蓝骍;舒正玉;吴继光;陈的;蒋咏梅;李欣;黄建忠;

2011, 0(04): 35-39.

摘要 ( 95 )

PDF (325KB) ( 457 )

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以Pseudomonas aeruginosa为代表的I.1亚家族脂肪酶和以Burkholderia cepacia为代表的I.2亚家族脂肪酶具有优良的手性化合物拆分性能,在绿色化工领域具有良好的开发潜力及其应用前景。I.1亚家族脂肪酶和I.2亚家族脂肪酶均采用II型分泌机制进行分泌,其分泌依赖于一种分子伴侣——脂肪酶的特异性折叠酶(lipase specific foldase,Lif)的协助。从Lif蛋白的分类、结构特点、介导对应脂肪酶折叠的特异性及机制、lif基因表达调控机制及尚待探讨的问题等方面系统介绍Lif蛋白的研究进展。

防御素构效关系研究进展

王少然;杨雅麟;张军;王建华;

2011, 0(04): 40-45.

摘要 ( 104 )

PDF (446KB) ( 601 )

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防御素是第一大类内源性抗微生物肽,具有广泛的抗菌谱作用,是生物体先天防御系统的重要组成成分。综述了近年国际上对防御素的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构及其构效关系研究的最新进展。

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

杨梅;温真;林丽玉;杨彩云;

2011, 0(04): 46-51.

摘要 ( 258 )

PDF (268KB) ( 1143 )

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选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键。毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质。简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展。

线粒体基因及其Cyt b基因与昆虫分子系统学研究

牛京京;张守纯;金谷;于宁;

2011, 0(04): 52-55.

摘要 ( 87 )

PDF (204KB) ( 593 )

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由于mtDNA及其Cyt b基因独特的进化速率及遗传特性,已成为追溯母系起源和群体遗传分化可信的遗传标记,被广泛应用于研究动物起源和分化,揭示群体的遗传背景,阐释种间和种内的系统演化关系,研究种内多态性和地理分布的关系。对mtDNA及其Cyt b基因的分子特点及其在昆虫系统学研究中的应用进行综述。

南美白对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒抗性相关基因的微卫星标记研究

许友卿;辛文伦;陈晓汉;陈秀荔;丁兆坤;

2011, 0(04): 56-59.

摘要 ( 107 )

PDF (239KB) ( 531 )

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传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是南美白对虾养殖中最普遍的虾病毒之一。它能引起生长缓慢和畸形,通称矮小畸形综合症(RDS)。分子标记是研究抗病基因的有效手段之一,微卫星(microsatellite)标记是新发展的遗传标记。介绍用微卫星技术对南美白对虾抗病和感病群体筛选出的IHHNV抗性相关基因进行研究。

栎树繁殖生物技术进展

方炎明;张聪颖;虞木奎;蔡奇英;廖婧;林剑雯;丁帆;

2011, 0(04): 60-65.

摘要 ( 101 )

PDF (259KB) ( 722 )

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栎树是重要的森林树种。由于常规营养繁殖困难、种子繁育开花结实迟等原因,栎树的繁育问题一直未得到很好的解决。综述栎树繁殖生物技术的历史与进展;分析栎树的体细胞胚胎从诱导到萌发的过程及机理;阐述欧洲栓皮栎等树种的小孢子胚胎发生技术、双单倍体培养技术、体胚遗传转化技术、人工种子技术以及相关的遗传稳定性与变异性检测技术。

RNA干扰技术的基础研究与应用

郭会灿;

2011, 0(04): 66-69.

摘要 ( 93 )

PDF (287KB) ( 683 )

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RNA干扰技术(RNAi)是一项高效率、强特异性的基因沉默技术。自1998年发现RNA干扰现象以来,RNAi吸引很多国内外科学家的研究兴趣。经过10多年的潜心研究,现在对该技术的参与成分、作用机理都有了较深入地了解。同时,随着生物学知识的完善和生物技术与基因工程的发展,研究人员对RNAi在基因功能研究、疾病(如肿瘤)相关的基因治疗、新药的研究与开发等方面的应用进行了广泛的探索,并且已经显示该技术的潜在应用价值,但是RNAi的自身缺陷制约了其在临床治疗等方面的实际应用。综述前人的研究结果,系统阐述了RNAi的发生、作用机理、缺陷以及其应用,为相关科学研究提供参考。

肿瘤的分子治疗新进展

李招发;惠二京;连文昌;

2011, 0(04): 70-75.

摘要 ( 82 )

PDF (259KB) ( 490 )

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肿瘤的发生、发展是一个多步骤、多基因参与的、复杂的系统性过程。分子治疗作为21世纪最有希望根治人类肿瘤的技术,其治疗技术的关键在于靶分子的选择,寻找合适的靶分子一直是分子治疗肿瘤的重要方向。针对近年来肿瘤治疗研究中发现的端粒酶靶标、抗血管生成基因靶标、apoptin、survivin、stathmin、autophagy、PUMA、转铁蛋白受体靶标和相应的治疗策略作一综述。

适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定

李俊毅;李想;褚庆华;吕蓉;张舒亚;潘良文;黄新;朱水芳;

2011, 0(04): 76-83.

摘要 ( 68 )

PDF (845KB) ( 844 )

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针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题,构建适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73,其包含转基因油菜RT73品系3'端侧翼序列,油菜内标准基因HMG和PEP片段。对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证,结果表明,标准分子pEASY-RT73高度特异于转基因油菜RT73品系。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中,3个目标片段的检测下限(LOD)均为10拷贝。实时荧光PCR检测的LOD均为25拷贝,定量下限(LOQ)均为50拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率介于0.96-1.02间,相关系数均大于0.999。分别以PEP和HMG为内标准基因对5个盲样的测试结果显示,测量值与设定值间偏差(Bias)介于-14.13%-14.29%间,SD小于0.20,RSD小于18.0%。因此,标准分子pEASY-RT73可很好地替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜RT73及其来源产品品系特异性检测。

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

郭天麒;李聪;王英博;韩烈保;

2011, 0(04): 84-88.

摘要 ( 68 )

PDF (402KB) ( 378 )

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Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用。以植物表达载体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点SmaⅠ和SacⅠ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA。用SmaⅠ和SacⅠ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4 DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA。通过冻融法将所获得的植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考。

坛紫菜hsp70基因真核表达载体的构建与转化

仪茜茜;杨锐;刘伟;孙雪;赖晓娟;

2011, 0(04): 89-92.

摘要 ( 84 )

PDF (465KB) ( 412 )

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坛紫菜是极具经济效益的大型海藻,生活在环境多变的潮间带,易受到温度、渗透压和辐射等因素剧烈变化的影响,经常处于逆境胁迫中。热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要且高度保守的应激因子,作为分子伴侣在胁迫条件下首先被诱导出来,在逆境胁迫调节中起着重要的作用。构建紫菜hsp70基因真核表达体系对于了解该基因在紫菜抗逆过程中的作用有重要意义。利用PCR技术扩增得到大小为1.89 kb的坛紫菜hsp70基因,将其克隆至pMD18-T载体上测序。从测序正确的菌株中提取质粒,经限制性内切酶SmaⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒p181AINE连接,获得重组真核表达质粒p181-hsp70。通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,结果表明重组真核表达质粒p181-hsp70构建成功。制备酵母感受态,将重组质粒电激转入酿酒酵母中,酵母菌落PCR结果显示电激转入成功。

农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究

徐春波;王勇;赵海霞;李兴酉;

2011, 0(04): 93-97.

摘要 ( 83 )

PDF (321KB) ( 489 )

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为建立高效的农杆菌介导的紫花苜蓿的遗传转化体系,对影响转化体系的若干因素进行了研究。结果表明,最适宜的条件分别为抗菌素为350 mg/L的羧苄青霉素(Carb);卡那霉素(Kan)筛选的浓度为60 mg/L;基因型为WL-323;外植体为下胚轴;农杆菌菌液浓度OD600值为0.4-0.6;侵染时间10 min;乙酰丁香酮(AS)的浓度为10 mg/L。

沙冬青cDNA-AFLP银染和条带回收方法分析

李召春;郭惠明;程红梅;

2011, 0(04): 98-101.

摘要 ( 91 )

PDF (536KB) ( 477 )

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通过比较而获得沙冬青cDNA-AFLP银染和条带回收的最佳方法。银染时采取Bassam法和Sanguinetti法,凝胶条带回收时利用直接回收法、试剂盒法、LiCl高盐法和聚丙烯酰胺凝胶高效回收法,比较不同方法对于开展聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响。采用Bassam银染法对获得的扩增产物进行染色后无法得到差异显示条带,而利用Sanguinetti银染法显色后可观察到比较明显的差异表达条带;以直接回收法、PAGE试剂盒法、LiCl高盐法对差异条带进行回收后,二次PCR无法得到扩增产物,采用聚丙烯酰胺凝胶高效回收法后则可获得比较清晰的二次扩增产物。Sanguinetti银染法和聚丙烯酰胺凝胶高效回收法是应用于本研究的最佳方法。

藏红花细胞悬浮培养动力学研究

陈书安;王晓东;袁晓凡;赵兵;王玉春;

2011, 0(04): 102-105.

摘要 ( 101 )

PDF (335KB) ( 446 )

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基于已经建立的藏红花细胞悬浮培养体系,研究了其悬浮培养动力学。结果表明,悬浮培养时细胞的生长周期约为20 d,在20 d时生物量达到最大,为12.3 g DW/L,但是藏红花素的合成周期大约为28 d,在28 d时藏红花素的含量和产量达到最大,分别为95.8 mg/g和0.92 g/L。藏红花素的积累与细胞的生长之间的关系为半生长偶联型,为其生物反应器放大培养提供了参数等理论依据。

长白猪×蓝塘猪及其杂种基因组甲基化片段克隆与分析

肖正中;刘小红;王翀;李加琪;莫德林;陈瑶生;

2011, 0(04): 106-111.

摘要 ( 86 )

PDF (397KB) ( 441 )

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应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对6头长白公猪和50头蓝塘母猪及51头长白×蓝塘杂交F1代3个群体基因组DNA胞嘧啶甲基化位点进行检测,旨在克隆和分析父母代猪及其杂种F1代之间基因组DNA共同甲基化片段和差异片段,并找到其同源基因。结果显示,从MSAP条带中分离、克隆得到18条3个群体共同的甲基化片段、10条母代独有的甲基化片段和9条杂交一代独有的甲基化片段,其中有1条3个群体共有的甲基化片段通过EST拼接和电子延伸后在NCBI数据库中找到同源基因,即猪类酪氨酸蛋白激酶Lyn基因(GeneID:LOC100152890,序列号:XM_001926250)。结果表明,长蓝杂交F1代与其父母代之间的基因组甲基化存在异同,为通过MSAP技术克隆猪基因组DNA甲基化片段及寻找其对应的甲基化基因提供可能,也会为将来研究这些甲基化基因表达调控机制奠定基础。

猪GM-CSF基因的克隆及其真核表达载体的构建

黄海军;高其双;钱运国;邵淑敏;黄远全;陈志华;陶弼菲;向敏;占才耀;夏瑜;王连芳;任远;

2011, 0(04): 112-115.

摘要 ( 97 )

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采用PCR方法从猪外周血液淋巴细胞cDNA中扩增出与预期设计大小相符的GM-CSF基因特异性条带,PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GM-CSF。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到山羊胎儿成纤维细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-pGM-CSF真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GM-CSF蛋白功能以及进一步将其开发为高档疫苗佐剂奠定了基础。

澳洲宝石鲈线粒体DNA COI基因的克隆与序列分析

张龙岗;郭金峰;孟庆磊;安丽;董学飒;付佩胜;

2011, 0(04): 116-119.

摘要 ( 87 )

PDF (377KB) ( 436 )

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对澳洲宝石鲈线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidase subunit I,COI)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COI序列进行了分析。结果显示,澳洲宝石鲈COI基因序列长度为631 bp,其中A、T、G和C 4种碱基的含量分别为27.7%,23.6%,29.8%和18.9%。与从GenBank中查到的其他4种鯻科鱼类的同源序列比对,邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树。结果显示,5种鯻科鱼类聚在一起,分为两个大的支系,其中花身鯻与条纹鯻首先聚成一支,然后与詹氏弱棘鯻和银锯眶鯻聚成的一支共同组成一个支系;而高体革鯻单独聚为一个支系,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。

大黄鱼CYP1A基因cDNA的克隆与表达分析

宋娟娟;钱伦;钱云霞;

2011, 0(04): 120-126.

摘要 ( 83 )

PDF (3138KB) ( 466 )

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由于外源化合物能诱导鱼类CYP1A(P4501A)的表达,因而它广泛被用作评价水环境污染生物标记物。利用RT-PCR结合RACE技术从大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏克隆了CYP1A基因全长cDNA序列。经分析,该cDNA的5'末端有175 bp的非翻译区,开放阅读框为1 566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,3'末端有857 bp的非翻译区,3'非翻译区有一个多聚腺苷酸信号及两个与mRNA的快速降解有关的AUUUA序列。推测大黄鱼CYP1A的氨基酸序列和欧洲鲈鱼的相似度最高达89.6%。用RT-PCR检测大黄鱼CYP1A的表达特征发现,在所检测的9个组织中均有表达,以肝脏、消化道、脾脏和肾脏的表达量较高。

太平洋牡蛎i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达

谢三群;丛丽娜;张欢;王丹;

2011, 0(04): 127-132.

摘要 ( 99 )

PDF (683KB) ( 388 )

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在双壳类软体动物牡蛎体内,溶菌酶(Lysozyme)在实现宿主免疫防御,破坏和消除侵入体内的病原中发挥着重要的作用。根据GenBank已有的太平洋牡蛎溶菌酶的全长cDNA序列(GenBank:AB179775),通过RT-PCR技术,从太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)中克隆得到溶菌酶(简称为CgLys)基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。生物信息软件分析表明,其ORF为414 bp,编码137个氨基酸(aa),前20个aa为信号肽,成熟肽由117个aa组成,其分子量为13.2 kD。通过构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较,初步推断该CgLys属于i型溶菌酶。将该CgLys基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-CgLys,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。该基因工程菌经IPTG诱导发酵后,成功高效地表达了重组CgLys蛋白,其分子质量约为18 kD。该重组CgLys蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中,即以可溶性蛋白形式存在。上述结果将显着简化后续的蛋白纯化过程,为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶提供参考。

寡肽转运蛋白PepT2原核表达质粒的构建及其表达初探

赵东欣;朱其丛;薛永亮;卢奎;

2011, 0(04): 133-136.

摘要 ( 80 )

PDF (386KB) ( 455 )

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寡肽转运蛋白(PepT2,peptide transporter,SLC15A2)是哺乳动物体内能够转运二肽、三肽的蛋白。研究表明,一些类肽的小分子药物也是PepT2的底物,但PepT2的结构与生物学功能尚待研究。建立稳定表达PepT2的表达体系是研究PepT2的重要环节。根据GenBank中人PepT2基因序列,借助Primer5.0设计了1对寡核苷酸引物,经PCR合成长达2 190bp的目的序列,通过重组构建pET30a(+)/PepT2表达质粒,测序分析确认目的基因中的3个碱基发生突变。初步研究了pET30a(+)/PepT2在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达,为PepT2原核表达的进一步科研和实际应用奠定了基础。

重组人IL-17A和IL-17F的制备方法及活性测定

贾军会;李慎涛;刘振龙;赵文明;

2011, 0(04): 137-142.

摘要 ( 111 )

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人IL-17A和IL-17F具有很高的同源性,在炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中都发挥着重要的作用,是当前研究的热点。应用原核表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了人IL-17A和IL-17F;经培养条件的优化,未发现可溶性目的蛋白的表达,免疫印记分析显示,重组蛋白位于包涵体中;对包涵体进行洗涤、凝胶过滤层析纯化和柱上复性,获得重折叠的可溶性蛋白;随后用SDS-PAGE对蛋白样品进行了纯度分析、采用免疫印记和质谱的方法鉴定蛋白产物成分、用MC3T3-E1和RAW264.7两个细胞株对IL-17A、IL-17F的生物学活性进行测定。结果显示,柱上复性的方法制备的该重组蛋白具有较高的纯度和活性。建立的重组人IL-17A和IL-17F的制备方法可为相关研究中细胞因子的大量应用提供参考。

重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体

芦春斌;高忱;

2011, 0(04): 143-146.

摘要 ( 92 )

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HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。

具有抑菌作用的放线菌GNF1的分离鉴定和生物学活性的研究

王磊;孙晗笑;李秀英;莫雪梅;张光;

2011, 0(04): 147-152.

摘要 ( 89 )

PDF (376KB) ( 455 )

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从几种复合微生物有机肥中分离出一系列不同的菌株,与实验室保存的菌株GNW(自生固氮菌)和HP2(解磷菌)混合接种培养,检测是否因基因杂交、突变等原因而产生具有抑菌作用的菌株。结果分离出一株具有抑菌作用的放线菌菌株GNF1,根据其形态学特征、生理生化特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果,鉴定其属于链霉菌属(Strepto-myces)的一个菌株,GNF1菌株的代谢产物中存在具有抑菌作用的活性成分,与植物根际促生菌GNW、HP2以及某些原核病原微生物共培养培养时能明显抑制它们的生长。

拮抗菌株Kc-t99的鉴定及其抑菌活性研究

任大明;张晓轩;董丹;刘伟成;刘德文;

2011, 0(04): 153-157.

摘要 ( 67 )

PDF (407KB) ( 425 )

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通过传统分类与分子生物学技术相结合的方法对从京郊菜园土壤中分离筛选的拮抗菌株Kc-t99进行鉴定,并采用生物测定的方法评价其抑菌活性。结果表明,菌株Kc-t99的形态学特征和生理生化特性与枯草芽孢杆菌基本一致,其16S rDNA序列与GenBank中已鉴定的枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性高达98.06%,据此初步确定其为枯草芽孢杆菌。抑菌试验表明该菌株对供试的5种病原真菌和4种细菌均具抑菌活性,其中对甘蓝枯萎病菌、黄瓜角斑病菌和桃褐腐病菌抑制作用显着。

两株真养产碱杆菌部分基因的克隆与序列分析

姚四新;赵淑秋;李学斌;王丽荣;王宪文;陈仕钧;张兆沛;王青;刘兴友;刘金华;

2011, 0(04): 158-161.

摘要 ( 74 )

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采用随机引物PCR技术从新建细胞培养室空气中获得两段长度414 bp及450 bp的片段。通过克隆测序及序列分析,结果表明,所测序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性分别高达79%-83%及79%-84%,由其推导的氨基酸序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性高达86.4%-89.1%,由两分离菌株所获得基因片段推导的氨基酸序列之间的同源性高达98.1%,从而确定所分离两菌株为真养产碱杆菌不同亚型的菌株。

黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

朱碧银;洪文荣;严绍德;朱宝泉;林玉双;封成军;

2011, 0(04): 162-166.

摘要 ( 96 )

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以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8。该质粒通过E.coli ET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49 AG1、Tt-49 AG2和Tt-49 AG3。通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点。以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高达1 000μg/mL以上。

大量Pichia pastoris酵母基因组DNA的提取

刘晓志;高健;韩柱;王志明;陈伟斌;

2011, 0(04): 167-170.

摘要 ( 93 )

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巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一,提取酵母基因组是研究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组DNA的制备方法进行比较,并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点,适合于大量DNA的提取。该方法的革新将对酵母重组子的PCR鉴定检测及表达产品DNA相关检测提供更高效稳定的保证,将成为酵母等类似微生物基因组DNA制备的首选方法。

树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

麻慧明;陈介南;张伟涛;何钢;

2011, 0(04): 171-175.

摘要 ( 88 )

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根据NCBI中的木糖还原酶基因序列设计引物,利用高保真聚合酶克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因,加A后克隆到质粒pGM-T中,测序验证。然后将目的基因克隆到含有强启动子的穿梭表达载体p424GPD中,构建含有XYL1基因的重组质粒p424GPD-XYL1。将p424GPD-XYL1转化到大肠杆菌中,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,酶活测定确定木糖还原酶基因XYL1在大肠杆菌中得到活性表达,表明表达载体构建成功。表达载体的成功构建为后续构建重组酿酒酵母利用木糖发酵奠定基础。

抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)产吩恶嗪酮合成酶基因的重组表达

谢迎春;贾红华;谢柏盛;朱清禾;贾丽莎;韦萍;

2011, 0(04): 176-180.

摘要 ( 101 )

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从抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)中提取出目的基因phs,构建基于质粒pET28a的诱导型表达载体pET28a-phs。以E.coli为表达宿主,将重组质粒转化入宿主菌之后获得能够高效表达吩恶嗪酮合成酶(PHS)的重组菌,经SDS-PAGE验证在72.1 kD处有明显蛋白条带。通过调整可能影响表达的参数获得PHS在大肠杆菌中的最优表达条件。最终优化后的表达条件是最适Cu2+浓度为1.5 mmol/L,最适细菌培养温度为37℃,最适pH值为7.0,在OD600为0.6,时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件,30℃诱导16 h为最佳诱导时间。

基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化

陈英;朱绮霞;张搏;陈东;黄日波;

2011, 0(04): 181-185.

摘要 ( 98 )

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利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来的40 mg/mL降低为12.5 mg/mL。对其三维结构进行分析,推测酶学性质的改变可能与处在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的I58A、和处在下部β卷曲折叠拐角处的S375G的突变有关。

外显子拼接法克隆紫杉烷2α-羟基化酶基因与生物信息学分析

黄仕杰;陈平;陈晓阳;辛燕花;郭丽琼;林俊芳;

2011, 0(04): 186-192.

摘要 ( 86 )

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紫杉烷2α-羟基化酶是形成紫杉醇核心骨架的羟基化反应关键酶之一,以taxusin作为底物进行氧化生成2α,7β-dihydroxytaxusin。利用蔓地亚红豆杉的总DNA为模板,采用PCR技术克隆出紫杉烷2α-羟基化酶的DNA序列,利用在线比对和生物学软件分析其内含子,采用外显子拼接法克隆出紫杉烷2α-羟基化酶基因的cDNA序列。测序结果表明该基因含有1个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸的多肽;同源性比较分析结果表明,其碱基序列及氨基酸序列与已经报道的加拿大红豆杉的紫杉烷2α-羟基化酶基因的一致性为分别为98%和89%。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其列进行了序列分析,为利用代谢工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。

侧耳木霉T2-1植酸酶基因的序列分析及蛋白结构预测

罗俊彩;扈进冬;吴远征;李晓龙;李纪顺;杨合同;

2011, 0(04): 193-198.

摘要 ( 96 )

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利用GenBank发表的植酸酶A编码序列设计的引物,通过PCR的方法对侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)T2-1基因组DNA进行扩增,获得了一条长约1.7 kb的特异性DNA片段。序列测定结果表明,该DNA片段含有植酸酶编码基因的完整序列和3段内含子序列,其中植酸酶基因全长1 443 bp,编码480个氨基酸,5'端有一段编码23个氨基酸的信号肽序列,其余的457个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。对该基因编码的氨基酸序列进行三级结构预测,发现它为磷酸单酯酶。已将侧耳木霉T2-1植酸酶基因序列在GenBank中注册(登录号:GQ325590)。这是目前中国在GenBank注册的第一个完整的木霉植酸酶编码基因。

吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶分离纯化方法改进及结构研究

杨晓燕;周哲敏;堵国成;陈坚;

2011, 0(04): 199-203.

摘要 ( 82 )

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利用改进的新方法,对吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶(TGase)进行分离纯化。将发酵上清液经过硫酸铵分级盐析后,用Hitrap Q HP阴离子交换柱除掉干扰较大的色素,之后又经Superdex 75 10/300GL凝胶柱和Hitrap Q HP阴离子交换柱的分离,得到高纯度的TGase。纯化后TGase的比活力可达24.5 U/mg,回收率为39.9%。TGase的N-末端前6个氨基酸经测序为DAADER。该研究是对吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列的首次报道。将吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列与已报道的其它3种链霉菌来源的TGase的N-端氨基酸序列进行比对,序列相似性不高。预测和分析了吸水链霉菌TGase的高级结构,为进一步研究TGase结构和功能的关系,蛋白分子定向改造提供理论依据。

非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

赵文华;杨仕标;王金萍;李富祥;

2011, 0(04): 204-207.

摘要 ( 97 )

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非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断。经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法。

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