当期目录

2015年 第31卷 第9期    刊出日期：2015-09-15

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综述与专论

植物iPGAM的研究进展

谢鑫, 刘娜, 魏凤菊

2015, 31(9):  1-7.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.001

摘要 ( 440 )   HTML   PDF (1303KB) ( 567 )  

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辅因子非依赖型磷酸甘油酸变位酶(Cofactor-independent phosphoglycerate mutase，iPGAM)是在真菌和高等植物中发现的金属酶，是糖酵解和糖异生过程中的一个关键酶。随着原核生物、无脊椎动物等物种中iPGAM基因被克隆、蛋白晶体结构的解析及其生物学功能的陆续报道，近些年，植物iPGAM的功能开始受到关注。阐述了植物iPGAM蛋白的结构特点及作用机制，着重对已报道的拟南芥、水稻和玉米中iPGAMs的系统进化关系以及生物学功能进行了概述。

基因工程和代谢工程在甜菊糖生产上应用进展

余波颖, 王宁琳, 李国婧, 夏亦荠

2015, 31(9):  8-14.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.002

摘要 ( 424 )   HTML   PDF (1264KB) ( 1015 )  

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甜菊糖是由原产于南美的多年生草本植物甜叶菊所产生的一种糖苷。中国广西一带的甜茶树也产生类似的糖苷。它们作为一种低能量、高甜度的天然甜味剂近几年在欧美、日本及中国得到越来越普遍的利用。中国是世界上最大的甜叶菊种植国。近年来甜菊糖代谢途径中的酶蛋白和有关基因的分离以及甜叶菊转化体系的建立，为通过遗传和代谢工程提高甜菊糖产量和改变甜菊糖苷的组成奠定了基础，也为利用微生物和其他高生物量作物产生甜菊糖提供了新的途径。就甜叶菊的生产、甜菊糖的利用现状以及甜菊糖在植物体内的代谢途径进行了总结。

油菜细胞质雄性不育与育性恢复机理的研究进展

刘琪迩, 杜坤, 王幼平

2015, 31(9):  15-22.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.004

摘要 ( 370 )   HTML   PDF (1114KB) ( 628 )  

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油菜细胞质雄性不育不仅是研究核质互作的理想材料，同时也是杂种优势利用的最有效方式之一。目前对油菜细胞质雄性不育的研究主要包括不育基因的来源、不育基因的结构特征、不育基因的作用机理以及育性恢复的分子机制等。对目前国际上主要的油菜细胞质雄性不育类型(pol CMS、nap CMS、kos CMS、ogu CMS和tour CMS)在分子水平上的研究进展进行了综述。包括线粒体不育基因相关区域的确定和结构特点，不育形成的分子机理以及恢复基因的定位和作用机制等。

内生菌对植物抗干旱胁迫能力的影响研究进展

曹凯, 李远婷, 安登第, 张瑞

2015, 31(9):  23-29.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.003

摘要 ( 426 )   HTML   PDF (1078KB) ( 745 )  

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随着我国经济的发展和人口的增加，人们对水资源的需求不断增加，许多地区出现不同程度的干旱半干旱现象，土地干旱直接制约着我国农作物的产量。提高农作物的抗旱性是我国农业发展亟待解决的难题。植物内生菌分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与宿主植物协同进化，其增强宿主植物抗逆性的特性引起了研究者的重视，并使之成为了新的研究热点。主要综述植物内生菌对植物抗干旱能力的影响。

极端嗜热微生物及其高温适应机制的研究进展

曾静, 郭建军, 邱小忠, 王贤卓, 袁林

2015, 31(9):  30-37.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.005

摘要 ( 452 )   HTML   PDF (1098KB) ( 2258 )  

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极端嗜热微生物在高温条件下生长繁殖，其必然具有适应高温环境的特殊细胞结构、基因类型以及生理生化机制。极端嗜热微生物的研究对探索生命的起源以及极端嗜热微生物的开发和应用具有重要意义。对极端嗜热微生物中细胞膜、核酸分子、蛋白质分子、代谢产物和辅酶的高温适应机制的研究进展进行了概述，旨为极端嗜热微生物以及来源于极端嗜热微生物的各种生物分子的开发和应用提供理论依据。

嗜热链球菌的特性与应用研究进展

田辉, 梁宏彰, 霍贵成, Evivie Smith Etareri

2015, 31(9):  38-48.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.006

摘要 ( 584 )   HTML   PDF (1191KB) ( 2826 )  

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嗜热链球菌是一种重要的工业用乳酸菌，广泛应用于发酵乳制品生产。近年来，对嗜热链球菌的研究已不仅仅停留于应用方面，而有关该菌基因组学等深层次特性机理的研究越来越多，对嗜热链球菌的研究和应用开发具有较好的参考价值。综述了嗜热链球菌的认定和应用、基因组学特征、发酵特性、噬菌体防御和共生机制等方面的研究进展，并展望了现代生物技术在嗜热链球菌特性研究中的应用前景。

提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状

殷子斐, 王丽娜, 王园, 凌晨

2015, 31(9):  49-59.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.007

摘要 ( 345 )   HTML   PDF (1611KB) ( 666 )  

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重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体是目前基因治疗研究中常用的、非常有前景的载体之一。欧洲第一个批准上市的基因治疗药物正是基于rAAV。然而，rAAV的转导效率相对有限，导致其治疗成本过高；且过高剂量的rAAV可以激发人体的免疫反应，降低其疗效。因此，如何提高rAAV的转导效率一直是基因治疗领域研究的热点之一。目前常用的提高rAAV转导效率的方法有：使用组织特异性强的血清型/变体、应用蛋白酶体抑制剂、突变衣壳蛋白表面裸露氨基酸、增加单链DNA的第二链合成、构建自身互补型双链载体等。就这些方法各自的原理、应用现状及优劣势进行系统地综述。

海产养殖饵料微藻开发利用进展

陈艳梅, 石阳, 王明兹, 陈必链

2015, 31(9):  60-65.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.008

摘要 ( 442 )   HTML   PDF (1057KB) ( 850 )  

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饵料微藻是在海产养殖过程中应用最普遍的生物饵料。饵料微藻营养成分全面以及富含多种活性物质，是海产养殖动物最佳的开口饵料，其还可有效去除水体中的氮磷，改善调节养殖水质，具有益生作用。综述饵料微藻在海产养殖应用开发过程中的功能、养殖工艺和保种技术等新进展。

生物技术在兽医领域的研究应用

狄荻

2015, 31(9):  66-69.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.036

摘要 ( 379 )   HTML   PDF (1042KB) ( 588 )  

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当今环境污染日益严重，危害人类的疾病时有发生，这对畜牧兽医业的现状与发展影响越来越大，对兽医工作是严峻的挑战。对此，采用现代生物技术研究和解决兽医领域的问题是兽医行业的发展方向。从预防兽医、临床兽医和兽医制药三方面综述生物技术在兽医领域的研究应用与发展趋势。

技术与方法

Mixture与响应面法结合开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基

汪梁, 刘旭平, 谭文松

2015, 31(9):  70-78.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.009

摘要 ( 483 )   HTML   PDF (1523KB) ( 1058 )  

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采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上，通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A:n>B:n>C:n>D:n>E:n>F=0:n>0:n>11:n>0:n>9:n>0。利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化，确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持BHK细胞悬浮生长，培养时细胞最大活细胞密度可达140.21×10⁵个/mL，比商业培养基提高了1.95倍。采用Mixture试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合BHK-21细胞生长的无血清悬浮培养基，为采用BHK-21细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。

丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法

罗中钦, 程琳, 张茜, 陈国华

2015, 31(9):  79-83.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.010

摘要 ( 437 )   HTML   PDF (1597KB) ( 917 )  

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以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为材料，旨为建立沸水浴获得PCR模板DNA的新方法。取少量真菌菌丝置于一定体积50 mmol/L NaOH溶液中沸水浴10 min，再加入1/10体积1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，12 000 r/min离心后，上清用作PCR的DNA模板。结果显示，该方法扩增效率高，扩增条带清晰，且Taq酶适应性强，适合快速制备丝状真菌的模板DNA。该方法经济、简单、快速、安全高效，可用于丝状真菌转化子的高通量筛选和菌株的快速鉴定。

研究报告

转基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉鸡肠道中的残留检测

徐灯, 耿丽丽, 张敏红, 卢凡, 张杰

2015, 31(9):  84-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.011

摘要 ( 323 )   HTML   PDF (1450KB) ( 515 )  

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旨在研究转基因水稻对饲喂肉鸡的影响，以含有转cry1Ab/Ac基因水稻的饲料饲喂肉鸡，分析了肉鸡空肠、回肠、盲肠、直肠中cry1Ab/Ac基因和蛋白残留情况，并用体外实验验证了外源基因的降解情况。结果表明，饲喂转cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉鸡肠道4个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留，体外消化外源基因的实验发现外源基因在肉鸡肠道中约4 h后开始逐步降解。对上述4个部位内容物进行ELISA和Western blot分析，均未检测到 Cry1Ab/Ac蛋白残留。综合分析表明，转基因水稻中的外源基因和蛋白在肉鸡肠道中易被消化和降解。

Cry1Ab/Cry1Ah杂合蛋白构建与功能研究

徐曼, 蒋健, 束长龙, 张杰, 宋福平

2015, 31(9):  91-96.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.012

摘要 ( 347 )   HTML   PDF (1526KB) ( 687 )  

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Cry1A类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白，目前已经报道的Cry1A类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的Cry1Ab与Cry1Ah蛋白开展研究，构建了Cry1Ab、Cry1Ah的杂合蛋白AhAhAb并测定了杀虫活性。结果显示，Cry1Ab、Cry1Ah的结构域交换引起蛋白杀虫活性的显著变化，与出发蛋白相比，杂合蛋白AhAhAb丧失了对棉铃虫杀虫活性，降低了对玉米螟、小菜蛾杀虫活性。利用生物信息学方法对Cry1Ah结构域I建模，并分析其与其他Cry1A蛋白结构及表面性质差异，分析表明Cry1Ah与Cry1Ab的结构域I有相同的碳骨架和二级结构，但是表面电势分布有较大差异。进一步分析杂合蛋白AhAhAb与Cry1Ab、Cry1Ah之间杀虫活性差异的原因对进一步揭示Cry1A类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。

新疆雪莲水孔蛋白sikPIP₁基因的克隆与功能分析

黎玉顺, 刘逸泠, 刘步仓, 穆建强, 祝建波

2015, 31(9):  97-105.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.013

摘要 ( 363 )   HTML   PDF (1767KB) ( 480 )  

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利用PCR技术从已建立的新疆雪莲cDNA文库中克隆雪莲水孔蛋白基因sikPIP₁，构建植物表达载体pBI121-sikPIP₁，利用农杆菌介导法获得转基因烟草，PCR和RT-PCR检测证明该基因成功导入并得以转录，并对检测结果均为阳性的植株通过水分胁迫和温度胁迫进行抗旱性和抗寒性分析。结果显示：(1)克隆得到长为880 bp，具有水孔蛋白特性的sikPIP₁基因，完整ORF为840 bp。(2)水分胁迫中，断水7 d后转基因烟草生长表型明显优于野生型烟草，生理指标测定结果显示，转基因烟草的相对电导率和丙二醛含量均低于野生型烟草，相对含水量高于野生型烟草。(3)不同温度胁迫处理，转基因烟草表型显著优于野生型，特别是0℃以下低温胁迫，野生型烟草出现严重的萎蔫，而转基因烟草受伤害程度较轻；生理指标结果显示转基因烟草相对电导率、丙二醛含量低于野生型烟草。结果表明，转sikPIP₁基因提高了烟草抗旱能力和抗寒能力。

甘蔗工艺成熟期SS和SPS酶活性与糖分积累的相关性研究

牛俊奇, 黄静丽, 赵文慧, 杨丽涛, 李杨瑞

2015, 31(9):  105-110.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.014

摘要 ( 314 )   HTML   PDF (1416KB) ( 701 )  

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以工艺成熟期甘蔗品种GT28(早熟)和ROC22(早中熟)+1叶和不同节间为材料，分析SPS、SS合成和SS分解方向酶活性与节间糖分积累的相关性。结果表明，+1叶中SPS、SS合成和分解方向的酶活性比蔗茎中高，说明+1叶代谢活跃，是蔗茎糖分不断积累的物质基础。节间SPS酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量都正相关，GT28节间SPS酶活性比ROC22中高。节间SS合成方向酶活性与锤度和蔗糖含量都负相关，GT28中SS合成方向酶活性比ROC22中低。而SS分解方向酶活性与ROC22节间锤度、可溶性糖和蔗糖含量都呈负相关，与GT28中呈正相关，未达到显著水平。说明成熟期节间SPS和SS合成方向酶活性提高有利于蔗糖的积累，而随着节间成熟，蔗糖含量可能是促使SS酶活性由合成方向向分解方向转化的一个重要调节因子。

高温胁迫诱导对白桦悬浮细胞三萜积累及防御酶活性的影响

常志凯, 白祎杰, 董恒, 尹静, 詹亚光

2015, 31(9):  111-118.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.015

摘要 ( 325 )   HTML   PDF (1654KB) ( 500 )  

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通过研究不同高温胁迫下白桦细胞的细胞活力，防御酶活性和总三萜含量的变化，确定诱导白桦细胞合成三萜的最适高温胁迫条件。35℃、40℃、45℃、50℃和55℃胁迫白桦细胞1、2和4 h，测定其细胞活力，防御酶(SOD、CAT和PAL)活性和总三萜含量。结果显示，45-55℃高温胁迫下，细胞活力显著下降，以50℃ 2 h处理下降最显著，是对照细胞活力的6.8%；SOD和PAL活性显著增加，以55℃ 4 h处理后24 h时SOD和PAL活性最高，分别较对照提高164.9%和159.6%；CAT活性受到抑制，以55℃ 2 h和4 h处理在12 h后取样最低。50℃处理2 h后24 h取样，细胞总三萜含量最高，浓度为76.66 mg/g，比对照提高105.6%。最终确定50℃胁迫2 h后24 h取样为利用高温胁迫诱导白桦悬浮细胞合成三萜类物质的最适温度胁迫条件。

莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶cDNA克隆及其酵母表达

宋燕子, 贾彬, 林柏成, 胡章立, 黄瑛

2015, 31(9):  119-124.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.016

摘要 ( 297 )   HTML   PDF (1514KB) ( 659 )  

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旨在预测并克隆莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶cDNA(cracs)，分析其在酵母中的功能。RT-PCR克隆cracs序列，ClustalW和MEGA6.0软件分别分析其编码蛋白保守序列和进化树，表达并分析其在酵母YB525中的底物偏好性。结果表明，首次在莱茵衣藻中克隆获得一个cracs，测序表明其序列大小为2 004 bp，编码667个氨基酸，编码蛋白crACS的预测分子量为72.3 kD，包含酰基辅酶A合成酶的两个保守区：AMP-binding区和FACS区。进化树比对显示，crACS与拟南芥的长链酰基辅酶A合成酶LACSs具有较高的同源性。酵母表达显示cracs编码蛋白能互补酵母YB525 LACS的缺陷表型，活化并优先利用C16:n>1和C14:n>0。莱茵衣藻cracs编码蛋白可活化外源脂肪酸，属于酰基辅酶A合成酶家族。

山羊Apaf-1和Apaf-2基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达

罗斌, 卢建远, 马力, 胡亮, 刘霜, 杨珂伟, 字向东

2015, 31(9):  125-130.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.017

摘要 ( 336 )   HTML   PDF (1557KB) ( 669 )  

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采集5只多胎金堂黑山羊和5只单胎藏山羊在发情期的卵巢、垂体等组织样，进行Apaf-1和Apaf-2基因的cDNA克隆、序列分析，以及定量PCR技术对其mRNA进行组织表达量研究。结果表明，克隆出Apaf-1基因长度为3 750 bp，编码1 249个氨基酸，Apaf-2基因编码区全长为318 bp，编码105个氨基酸。这两个基因在两种山羊中序列相同，没有突变，且在5种组织中的表达均无差异。表明凋亡基因Apaf-1和Apaf-2在动物的进化中比较保守，与山羊多羔性状的相关性需要进一步研究。

斜带石斑鱼IL-10基因的克隆及其原核表达

肖周婷, 黄郁葱, 简纪常, 鲁义善, 吴灶和

2015, 31(9):  131-137.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.018

摘要 ( 338 )   HTML   PDF (1698KB) ( 727 )  

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白介素10(Interleukin-10，IL-10)是一个重要的多效细胞因子，主要作用是介导炎症反应和调控一些免疫细胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技术获得全长为1 104 bp的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IL-10基因。该基因ORF为564 bp，编码187个氨基酸，预测蛋白分子量为21.7 kD，等电点为5.74。氨基酸同源性比对及进化分析结果显示，斜带石斑鱼IL-10氨基酸序列和吉富罗非鱼(O. niloticus)同源性最高，达72.25%。利用双酶切及质粒重组技术构建IL-10原核表达载体，并转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导原核表达。SDS-PAGE分析显示，融合蛋白分子量为37.5 kD，与预期相符；在IPTG为0.02 mmol/L，37℃诱导3 h，蛋白包涵体的表达量最大。

三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长cDNA克隆与组织表达

施秋燕, 杨志刚, 王伟, 姚琴琴, 王瑶, 成永旭

2015, 31(9):  138-145.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.019

摘要 ( 259 )   HTML   PDF (1786KB) ( 563 )  

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旨在探讨三疣梭子蟹高度不饱和脂肪酸自身合成能力，探究三疣梭子蟹HUFA生物合成途径。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到三疣梭子蟹△6去饱和酶cDNA 全长序列，并利用荧光定量PCR技术进行肝胰腺、肠道、鳃等8种组织的表达分析。通过分析序列表明，基因序列全长2 875 bp，其中5'非编码区长465 bp，3'非编码区长1 078 bp，开放阅读框(ORF)长1 332 bp，编码443个氨基酸；并且编码的蛋白序列具有典型的去饱和酶特性：3个组氨酸保守区，一个N端细胞色素b5结构域以及一个血红素结合的HPGG结构域。荧光定量PCR结果显示，Δ6脂肪酸去饱和酶基因在三疣梭子蟹多个组织中均有表达，在肝胰腺中表达量最高，其次是肠道和肌肉，心脏中表达最少。结果表明三疣梭子蟹具有△6去饱和酶。

诸氏鲻虾虎鱼转录组序列中微卫星标记的初步筛选及特征分析

蔡磊, 余露军, 陈小曲, 叶惠欣, 陈琳, 李建军

2015, 31(9):  146-151.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.020

摘要 ( 329 )   HTML   PDF (1290KB) ( 688 )  

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旨在为大规模开发诸氏鲻虾虎鱼微卫星标记，采用高通量测序技术，对诸氏鲻虾虎鱼肝脏转录组进行了测序。结果共获得47 979条Unigenes，利用微卫星查找程序在47 979条Unigenes中共获得6 225个微卫星位点(12.97%)，平均每7.02 kb就出现1个微卫星位点。6 225个微卫星位点由226种重复基序组成，主要分布在三、四和五碱基重复类型中。在数量上，单碱基重复类型微卫星位点最多，占42.49%，二碱基和三碱基重复类型所占比例相似，分别为25.22%和26.27%，四、五、六重复类型较少，合计占6.03%。单碱基重复序列中最多的类型为A/T，二碱基重复序列中以AG/CT重复单元为主，三碱基重复序列中以AGC/TCG为优势类型。挑选部分二、三和四单元重复类型微卫星序列，共设计76对引物，可稳定扩增出目的条带的有55对，其中32对具有多态性。结果表明，利用诸氏鲻虾虎鱼转录组数据可快速大量开发微卫星标记。

玉竹褐斑病拮抗细菌的分离筛选和鉴定

毕博, 孟庆龙, 包京姗

2015, 31(9):  152-157.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.021

摘要 ( 345 )   HTML   PDF (1273KB) ( 848 )  

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从吉林农业科技学院药植园采集的玉竹根际土壤中分离、纯化获得90株细菌，运用平板对峙法筛选出16株对锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)具有较好拮抗作用的菌株。采用生长速率法对抑菌能力最强的G-27菌株进行抗菌谱的测定，并进行盆栽实验以验证其对玉竹褐斑病的防治效果。抑菌实验结果表明，G-27菌株发酵液对锐顶镰孢菌的抑制率达87.67%，同时对辣椒疫霉病菌等10种植物病菌也具有较好的抑菌作用，展现了较好的广谱抑菌作用。盆栽实验结果表明，G-27对玉竹褐斑病的防治效果为70.01%和71.52%，与农药对照组相比均具有显著差异(P<0.05)，其20倍稀释的发酵液的防效仍能达到50%以上。经形态特征、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列分析，确定G-27为解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

檀香炭疽病拮抗细菌的分离筛选及鉴定

田媛媛, 周国英, 左杰, 刘倩丽, 杨权

2015, 31(9):  158-162.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.022

摘要 ( 371 )   HTML   PDF (1562KB) ( 891 )  

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旨在从海南省国营澄迈林场的土壤中筛选出对檀香炭疽病具有较强生防效果的拮抗细菌。采集澄迈林场檀香不同种植区中优良单株的根际土壤，通过稀释平板法从中分离出71株细菌，以檀香炭疽病原菌为靶标菌，通过平板对峙法初筛和发酵液法复筛，获得一株具较强拮抗效果的细菌，编号为TXJ2-6；抗菌谱测定表明，该拮抗菌株对降香黄檀炭疽病、油茶软腐病、油茶叶枯病、油茶根腐病、油茶炭疽病5种病原真菌也具有明显拮抗效果；通过形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，鉴定该拮抗菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

耐盐芽孢杆菌LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究

曹建斌, 于慧瑛, 李新

2015, 31(9):  163-169.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.023

摘要 ( 333 )   HTML   PDF (1688KB) ( 529 )  

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旨在从运城盐湖黑泥样品中分离获得一株耐盐细菌LAY，对其进行分类鉴定及抗菌特性研究。基于16S rRNA基因序列对菌株进行分类鉴定。以白色念珠菌为指示菌，采用杯碟法对菌株LAY发酵上清液进行抗菌活性检测，研究不同因素对其抗菌活性的影响；采用扫描电镜和透射电镜观察其抗菌效果，并对菌株基因组进行功能基因的PCR筛查。系统发育分析表明，菌株LAY为Bacillus属成员，为耐盐细菌。电镜观察发现，菌株LAY发酵上清液可导致白色念珠菌细胞结构出现明显异常。抗菌稳定性研究表明，菌株LAY发酵上清液活性较为稳定，表现出良好的对温度、pH、NaCl和紫外光的耐受性。功能基因筛查发现菌株LAY基因组中含有聚酮合酶(PKS)基因，表明该菌具有产聚酮类化合物的潜力。结果表明，盐湖环境中的极端微生物资源可作为抗菌活性物质的潜在新来源。

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其抑菌条件研究

张超, 王祥红, 徐涛, 李帅, 钱浩, 李帅, 张增虎

2015, 31(9):  170-176.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.024

摘要 ( 342 )   HTML   PDF (1512KB) ( 653 )  

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旨在从海洋环境中分离筛选抑制鲈鱼病原鳗弧菌的拮抗菌，进行菌种鉴定，并对其抑菌条件及药物敏感性进行研究。采用十字交叉划线法和平板点种法筛选鲈鱼病原鳗弧菌的拮抗菌，采用形态学、生理生化反应及16S rDNA基因序列的系统发育分析方法对分离拮抗菌进行鉴定，采用单因子变量法对拮抗菌WTD的最佳抑菌条件进行研究，采用平板药敏纸片法对其药物敏感性进行研究。结果显示，从海洋环境样品中分离出126株细菌，筛选出19株拮抗菌。其中菌株WTD的拮抗效果最强，细菌鉴定结果表明，该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。最佳抑菌条件研究表明，该菌在温度35℃、pH7、盐度为1% NaCl的时候，拮抗效果最好。药敏实验结果表明，该菌对麦迪霉素等29种抗生素敏感，而对多粘菌素具有抗性。拮抗菌解淀粉芽孢杆菌WTD对鲈鱼病原菌鳗弧菌有较强的抑制作用，具有潜在的应用价值。

高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用

朱慧明, 张彦, 杨洪江

2015, 31(9):  177-182.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.025

摘要 ( 384 )   HTML   PDF (1431KB) ( 1140 )  

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筛选高产铁载体的微生物，研究铁载体的抑菌作用和对不溶性未定型铁氧化物(poorly crystalline iron hydroxides，PCIH)的利用。CAS法筛选高产铁载体菌株，采用琼脂扩散法和生长抑制测定铁载体的抑菌作用，利用16S rRNA基因序列比对鉴定分离菌株，并根据分离菌株的生长情况，确定铁载体对不溶性PCIH的利用。从土壤样品中共筛选到172株产铁载体的菌株，高产铁载体菌株13株，其中仅有菌株Z158的发酵液对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌具有抑菌作用，抑菌率分别为51.3%、50.2%、37.1%和28.0%。比对该菌株的16S rRNA基因序列，确定Z158属于Pseudomonas aeruginosa。当不溶性的PCIH作为唯一可利用的铁源时，菌株Z158培养24 h的生物量比无铁条件下提高了46.1%。铜绿假单胞菌Z158分泌的铁载体能够抑制病原菌的生长，同时还能获取不溶性未定型铁氧化物PCIH中的铁元素。

MntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

王慧, 崔云风, 刘岩, 史吉平, 赵志军, 王绍明

2015, 31(9):  183-189.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.026

摘要 ( 397 )   HTML   PDF (1992KB) ( 618 )  

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构建Mn²⁺转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌，并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化，确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为：甘油 7.0 g/L，酵母粉 3.75 g/L和蛋白胨 11.25 g/L；当培养基中的Mn²⁺浓度为1 mmol/L时，最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外，最佳的培养基初始pH值及培养温度分别为：pH 8.0和37℃，在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h，过氧化氢酶活最高可达476 U/mL是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中，过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/mL。

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

张瑶, 路国兵, 周波, 王冰, 牟志美

2015, 31(9):  190-196.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.027

摘要 ( 353 )   HTML   PDF (1913KB) ( 652 )  

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旨在对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)Lu10-1产脂肪酶的发酵条件及酶学性质进行研究。通过单因素和正交实验探讨了碳源、氮源、诱导物、初始pH值、温度等主要发酵参数的影响，并初步考察了温度、pH、金属离子和有机溶剂等对其催化反应的影响。结果表明，B. cepacia Lu10-1产脂肪酶最佳培养基组成和发酵参数为：可溶性淀粉1.5%，蛋白胨1.5%，橄榄油3 g/L，K₂HPO₄ 2 g/L，发酵温度32℃，初始pH 9.0，培养48 h酶活达12.4 U/mL，比初始酶活提高了2.7倍。酶的最适温度和pH值分别为60℃和9，在60℃以下保持100 h酶活仍保持在80%以上，在pH5.0-10.0之间活性稳定，对甲醇、乙醇等有机溶剂耐受性好。

综述与专论

重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的氨基酸添加策略优化

王德正, 吴辉, 李志敏, 叶勤

2015, 31(9):  197-203.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.028

摘要 ( 439 )   HTML   PDF (1326KB) ( 782 )  

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对表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽(Glutathione，GSH)进行氨基酸添加策略优化，结果表明：基本培养基中未添加氨基酸时GSH产量为0.81 g/L；诱导2 h后添加17 mmol/L半胱氨酸GSH产量为1.16 g/L，比不加氨基酸提高43 %；添加17 mmol/L的3种前体氨基酸，GSH产量达到3.86 g/L，比只添加半胱氨酸提高2.33倍；进一步提高3种氨基酸添加量至25 mmol/L，GSH产量可达4.64 g/L，比不添加氨基酸提高4.73倍，总生产强度高达317.8 mg/(L·h)，半胱氨酸转化为谷胱甘肽达到0.60 mol/mol；考察氨基酸添加模式发现一次性添加25 mmol/L氨基酸较恒速流加模式生产速率提高了29.8%。后续在50 L罐放大生产GSH，产量为4.31 g/L，总生产强度达到310.1 mg/(L·h)，为工业化放大生产GSH奠定了基础。

研究报告

内蒙古西部地区本土葡萄酒酿酒酵母发酵特性研究

王凤梅, 马利兵

2015, 31(9):  204-208.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.029

摘要 ( 342 )   HTML   PDF (1160KB) ( 623 )  

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对内蒙古西部地区分离得到的6株酿酒酵母进行了发酵特性的比较。首先对酵母进行了耐酒精、耐SO₂、耐低温、耐低pH、耐高糖和耐高盐的测试，随后进一步通过葡萄汁的发酵实验，分析比较了菌株的发酵力、酒精度、残糖量、总酸和挥发酸含量等理化指标，最终筛选出两株发酵性能优良的菌株，有望应用于内蒙古西部地区特色葡萄酒的生产。

大肠杆菌K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究

闫霞, 吴剑荣, 郑志永, 詹晓北

2015, 31(9):  209-217.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.030

摘要 ( 249 )   HTML   PDF (1902KB) ( 572 )  

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通过不同装液量、不同氧化还原状态的碳源和添加NAD⁺的前体烟酸来调控大肠杆菌胞内的能荷、还原力水平，研究胞内核苷酸和聚唾液酸合成之间的关系。结果表明，聚唾液酸合成量越高，胞内UTP含量越低、UMP含量越高；同时，合成UTP、CTP消耗大量ATP使胞内能荷水平较低。与其他碳源的发酵相比，以山梨醇为碳源时，由于胞内NADH水平的提高使菌体合成的聚唾液酸量最高。添加烟酸可以提高胞内的NAD⁺水平，导致胞内的氧化水平提高，从而使胞内还原产物如聚唾液酸、琥珀酸、乳酸的产量降低甚至消失。

NNK对NCTC 1469细胞毒性作用的研究

韩亚伟, 王西华, 陈利平, 时桂芹, 孙丽萍, 周文珊

2015, 31(9):  218-223.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.031

摘要 ( 513 )   HTML   PDF (1490KB) ( 823 )  

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研究4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)对小鼠肝细胞NCTC 1469细胞的毒性作用。利用MTT比色法检测5个不同NNK浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)对细胞的毒性作用；倒置相差显微镜观察细胞的形态变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR检测凋亡基因Bcl-2和Bax的表达。MTT显示，NNK能降低NCTC 1469细胞存活率，并呈剂量和时间依赖性。镜检结果可见细胞皱缩，密度降低；流式细胞仪检测显示，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的NNK作用24 h后凋亡率分别为(16.79±2.01)%、(26.87±1.67)%、(41.78±3.19)%、(50.89±3.94)%和(65.86±4.54)%，显著高于对照组(7.46±1.58)%；荧光定量PCR结果显示，随着NNK浓度的增加，Bcl-2 mRNA的表达减少，Bax mRNA的表达逐渐上升。NNK能够降低NCTC 1469细胞存活率并诱导其凋亡，作用呈剂量和时间依赖性。

豚鼠和BALB/c小鼠对SEC2超抗原作用敏感性的比较

孟北乾, 张惠文, 张国俊, 徐明恺, 李旭, 张成刚

2015, 31(9):  224-231.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.032

摘要 ( 316 )   HTML   PDF (1689KB) ( 580 )  

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比较分析豚鼠和BALB/c小鼠对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcus enterotoxin C2，SEC2)超抗原作用的敏感性差异，确定更适合用于SEC2超抗原作用研究的模式动物。体外试验，以梯度浓度SEC2刺激豚鼠和BALB/c小鼠的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和脾淋巴细胞，MTS染色法检测其增殖；体内实验，SEC2腹腔注射豚鼠和BALB/c小鼠，每隔3 d检测豚鼠和小鼠的体重、体温变化情况；每隔7 d采血，ELISA法检测血清中IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌水平。不同浓度的SEC2均能刺激小鼠的PBMC和脾淋巴细胞显著增殖(P<0.05)，而对豚鼠的PBMC和脾淋巴细胞无效。腹腔注射后，SEC2组和对照组豚鼠和小鼠的体温均无显著性变化(P>0.05)；豚鼠SEC2组体重在给药后期显著低于对照组(P<0.05)，小鼠的SEC2组体重在给药后第3-30天均显著低于对照组(P<0.05)，此后恢复到正常水平(P>0.05)；给药后各时间点，小鼠的SEC2组血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌水平均显著高于对照组(P<0.05)，而豚鼠的SEC2组血清中细胞因子分泌水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。与豚鼠相比，BALB/c小鼠对SEC2超抗原活性的敏感程度更高，且表现出很好的剂量和时间效应，适合作为模式动物用于SEC2的超抗原活性研究。

黄体生成素受体基因在牦牛发情周期不同阶段生殖系统中的表达模式

胡威, 崔燕, 潘阳阳, 李谷月, 何翃闳, 熊力, 余四九

2015, 31(9):  232-237.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.033

摘要 ( 394 )   HTML   PDF (1611KB) ( 714 )  

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旨在检测黄体生成素受体(Luteinizing hormone receptor，LHR)基因在牦牛发情周期不同阶段生殖系统中的表达。实验选取青海健康的处于卵泡期和黄体期的2岁龄雌性牦牛各3头，根据黄牛LHR基因序列5'端和3'端的保守序列设计特异性引物，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法分析牦牛发情周期不同阶段，生殖系统中LHR基因的相对表达量。结果显示，LHR基因在牦牛发情周期不同阶段生殖系统中的表达量存在差异，卵巢和输卵管中卵泡期LHR基因的表达量高于黄体期，黄体期子宫中LHR基因的表达量高于卵泡期。研究表明牦牛在发情周期不同阶段生殖系统中LHR基因的表达量存在差异，提示LHR在牦牛的繁殖过程中对生殖系统具有重要的调节作用。

抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究

胡祖权, 李和平, 吴平, 廖玉才, 张静柏

2015, 31(9):  238-243.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.034

摘要 ( 284 )   HTML   PDF (1589KB) ( 606 )  

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通过优化诱导表达条件，实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体FvSG7转化到大肠杆菌XL1-Blue中，确定诱导表达培养基，在不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌，通过Western杂交和ELISA检测分析单链抗体的可溶性表达情况以及抗体的活性。重组大肠杆菌培养至OD_600nm为0.5时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG，25℃诱导表达2 h可获得最大量的可溶性单链抗体。通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化，可以显著提高FvSG7抗体在大肠杆菌XL1-Blue周质中的表达量。

重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测

李斌, 许晓亚, 杨刚刚, 崔晴晴, 杨亚娟, 徐存拴

2015, 31(9):  244-250.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.035

摘要 ( 351 )   HTML   PDF (1700KB) ( 552 )  

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在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素-1α(rhIL-1α)，优化rhIL-1α的发酵工艺及纯化方法，以获得高表达、高纯度具有生物学活性的rhIL-1α。通过PCR扩增获得hIL-1α基因，构建其真核表达载体pPICZαA/hIL-1α，电转化至毕赤酵母X-33，用PCR和SDS-PAGE方法筛选高效表达rhIL-1α的工程菌株并进行Western blot鉴定，DEAE 弱阴离子离子交换层析一步纯化表达产物，并用MTT法初步检测其对人肝癌细胞7402的生物学作用。rhIL-1α在摇瓶规模下，经甲醇诱导4 d后表达量约为30 mg/L。Western blot检测rhIL-1α的特异性结合，获得纯度约95%，收率40%左右的rhIL-1α，并证明rhIL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。构建了重组hIL-1α的基因工程菌，并在毕赤酵母中实现了高效表达，为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础。