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2017年 第33卷 第6期    刊出日期：2017-06-26

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综述与专论

硫化氢信号与其它信号交互作用调控植物的耐旱性

周志豪, 王月, 闵雄, 李忠光

2017, 33(6):  1-9.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1138

摘要 ( 268 )   HTML   PDF (1375KB) ( 776 )  

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硫化氢（H₂S）是继一氧化碳（CO）和一氧化氮（NO）后植物体内发现的第三种气体信号分子,参与种子萌发、植物生长发育及耐逆性的获得等生理过程。干旱是限制作物产量的最主要的环境胁迫因子。近年来,H₂S也已被证实参与植物耐旱性的形成。结合最新的研究进展,在讨论H₂S信号与其它信号分子如活性氧（ROS）、NO、CO、脱落酸（ABA）、乙烯（ETH）、microRNAs等交互作用的基础上,从气孔运动、渗透调节物质、抗氧化系统、甲基乙二醛脱毒系统、热激蛋白等方面,综述了H₂S诱导植物耐旱性形成的可能机理,并提出了未来的研究方向。进一步拓展了H₂S信号的生理功能和植物耐旱性形成的机理,对深入研究H₂S与植物耐逆性包括耐旱性的关系,具有重要的指导意义。

漆酶的来源及固定化漆酶载体研究进展

邓寒梅, 邵可, 梁家豪, 陈烨同, 阎光绪

2017, 33(6):  10-15.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0892

摘要 ( 298 )   HTML   PDF (1035KB) ( 802 )  

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漆酶是一种多酚氧化酶,可催化氧化多种难降解有机污染物,在环境污染防治领域具有良好的应用前景。总结了植物漆酶、动物漆酶以及微生物漆酶的研究现状,详细讨论了漆酶固定化载体的研究进展,进一步指出了目前漆酶研究存在的问题,并提出未来的研究方向,旨在为漆酶的开发与应用研究提供参考。

miR-143生物学功能的研究进展

甘麦邻, 杨露, 谭娅, 杨琼, 蒲红州, 张顺华, 朱砺

2017, 33(6):  16-23.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1158

摘要 ( 237 )   HTML   PDF (1090KB) ( 456 )  

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microRNA 是一类广泛存在于真核生物中长度约为21-25 nt的非编码RNA,通常在转录后水平抑制靶基因的表达。miR-143广泛存在于不同物种中,近年来的研究表明miR-143是一个典型的多功能microRNA。现就miR-143在细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤发生等方面的生物学功能进行综述,以期为相关研究提供参考。

TRAF6与肿瘤关系的研究进展

李妙, 周立军

2017, 33(6):  24-31.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1137

摘要 ( 285 )   HTML   PDF (1518KB) ( 868 )  

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肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）是肿瘤坏死因子受体相关因子家族的一员,研究发现其在许多恶性肿瘤中高表达,并且在肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡过程中发挥重要作用。随着对TRAF6与不同类型肿瘤关系的深入研究,干扰或者抑制TRAF6在与肿瘤相关信号通路中的作用或许可以为癌症治疗提供新的策略。根据TRAF6的生物学特性及其在肿瘤相关信号通路中的重要作用,综述了TRAF6与肿瘤的关系,探讨了TRAF6在肿瘤治疗中的重要意义,旨在为今后以TRAF6为靶点的癌症治疗提供理论依据。

聚合物和卵磷脂纳米胶束递药系统的研究进展

李亚子, 徐书景

2017, 33(6):  32-38.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1084

摘要 ( 309 )   HTML   PDF (1066KB) ( 559 )  

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临床应用中,难溶性药物不仅会严重影响治疗效果,还可能会引起一系列的毒副作用,因此,难溶药物的递药系统成为研究的热点。纳米胶束系统就是目前最有效的递药系统之一,该系统主要由亲水性的外壳和疏水性的内核组成。纳米胶束作为一种纳米尺寸的递药系统具有许多独特的优势,如可有效避免血液循环中药物的提早释放,降低毒副作用、提高靶向性,进一步增加生物对难溶药物的利用度等优势,在难溶药物的递药系统中展现出良好的应用前景。综述了聚合物胶束和卵磷脂胶束的类别、构成、表征及其毒性和药代动力学检测方面的应用研究。

技术与方法

基因编辑技术最新研究进展

刘玉彪, 许馨, 曹山虎, 孙绍光

2017, 33(6):  39-44.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1168

摘要 ( 434 )   HTML   PDF (1640KB) ( 1271 )  

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基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来,基因编辑技术发展日新月异,不仅极大的推动了基因功能研究进程,同时为人类遗传疾病的治疗带来了曙光。综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、Ago/gDNA和SGN等技术的作用原理、优缺点、应用等,以期为相关领域的研究提供参考。

CRISPRs基因编辑技术研究进展

郝梦圆, 曲晓军, 崔艳华

2017, 33(6):  45-53.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1085

摘要 ( 255 )   HTML   PDF (1723KB) ( 614 )  

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CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因簇是一段成簇的短间距回文非编码序列,它可以通过整合新的间隔子序列实现对入侵外源DNA的记忆,而Cas（CRISPR-associated protein）蛋白则负责辅助CRISPR的转录产物crRNA（CRISPR RNA）,对外源DNA进行切割。二者协作组成了生物体的CRISPR-Cas系统,发挥抵御外源DNA侵染的作用。目前,CRISPR-Cas系统凭借着高效、简单、低成本、高特异性的独特优势迅速吸引了整个科学界的注意,成为研究的一大热点。对CRISPR-Cas系统的组成、结构、分型以及CRISPR技术作用机理、优势等做了详细的介绍,并以嗜热链球菌为例,分析了CRISPR基因的碱基排布及其高级结构,旨在为分子生物学及相关领域的科学研究提供参考。

用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法

赵紫霞, 徐桂彩, 李炯棠, 杨世勇

2017, 33(6):  54-61.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1067

摘要 ( 289 )   HTML   PDF (2834KB) ( 372 )  

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旨在开发用于水产品物种鉴定的检测方法,以鉴别虹鳟（Oncorhynchus mykiss）假冒大西洋鲑（Salmo salar）的现象。根据大西洋鲑和虹鳟基因组序列相似性比对结果,在核基因肌红蛋白基因区设计了三对聚合酶链式反应扩增引物,分别为大西洋鲑特异性引物、虹鳟特异性引物和鲑鳟通用引物。在上游引物5'端标记生物素分子,使扩增产物被亲和素修饰的电极表面捕获锚定,在下游引物5'端标记二茂铁分子,使扩增产物带有电化学信号。基于以上方法构建了电化学生物传感体系,通过循环伏安信号检测特定扩增引物,从而能够鉴别样品是否来源于大西洋鲑或虹鳟。本研究构建的电化学生物传感检测方法具有准确、清洁的特点,能够用于成鱼、鱼苗、鱼卵、鱼肉及其加工制品的物种鉴定,并能够从混有其他物种DNA的样品如鱼泥中成功检测鱼肉DNA的物种来源。

研究报告

过表达长春花JAR1基因促进文朵灵和长春质碱的生物合成

徐岩, 韩玉乾, 于放, 刘志文, 王燕燕

2017, 33(6):  62-68.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1176

摘要 ( 320 )   HTML   PDF (3176KB) ( 538 )  

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通过克隆长春花JAR1基因并在长春花叶片中瞬时过表达,研究该基因对文朵灵及长春质碱生物合成的调控。以总cDNA为模板,克隆JAR1基因,并构建重组质粒pBIGD-JAR1。经农杆菌介导瞬时转化长春花叶片后,利用半定量RT-PCR与高效液相分析JAR1过表达对文朵灵及长春质碱合成的影响。结果显示,成功从长春花叶片中克隆1 700 bp左右的JAR1基因;瞬时转化pBIGD-JAR1的长春花叶片中JAR1基因的转录水平高于空载体对照;JAR1的过表达诱导了合成途径中关键酶基因CrTDC、CrG10H、CrDL7H、CrSTR、CrLAMT的表达,以及文朵灵和长春质碱的积累。结合实验结果分析,JAR1基因过表达可能通过促进茉莉酸（JA）信号转导途径来诱导关键代谢途径酶基因的表达进而促进长春花中文朵灵和长春质碱的积累。

干旱胁迫下蒙古沙冬青叶片蛋白质组学研究

付晨熙, 肖自华, 高飞, 周宜君

2017, 33(6):  69-80.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0012

摘要 ( 272 )   HTML   PDF (2638KB) ( 320 )  

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通过对蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f]叶组织干旱胁迫下蛋白质组变化的研究,从蛋白表达水平阐释其应答干旱胁迫的分子机制。以20% PEG 6000胁迫处理1 h和72 h,以0 h为对照,提取叶片总蛋白,利用双向电泳和质谱鉴定技术分析差异表达蛋白。共鉴定了40个差异表达蛋白,按功能可分为9类：光合作用,ROS清除,蛋白的合成、加工与降解,物质运输,防御相关,RNA加工,氨基酸代谢,其他相关蛋白和功能未知蛋白质。蒙古沙冬青叶片应答干旱胁迫的核心是叶绿体结构和光合作用的维持。

甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶提高转基因烟草的抗旱性

刘延娟, 杨玉梅, 刘娴, 高艳秀, 袁航, 龚明, 邹竹荣

2017, 33(6):  81-88.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1208

摘要 ( 318 )   HTML   PDF (5044KB) ( 292 )  

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由焦磷酸（PPi）驱动的膜整合焦磷酸酶（PPase）在生物适应逆境方面可能起着重要作用,包括H⁺-PPase、Na⁺-PPase和Na⁺,H⁺-PPase三个亚家族。相比于H⁺-PPase,其它两个亚家族PPase近年来才在原核生物（特别是动物肠道菌）中被发现,有关它们的应用研究更是匮乏。通过两轮巢式PCR从人肠道宏基因组中扩增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶（CmPP）全长基因。序列分析表明该基因含有一个完整的ORF（长2 100 bp,编码一个699 aa的蛋白质,G+C含量为59.9 %,碱基分布均衡）。膜拓扑学结构预测CmPP是一个由16个跨膜α螺旋组成的膜蛋白,与目前已鉴定过的膜PPase跨膜结构相符。序列比对分析推测CmPP属于K⁺依赖型Na⁺,H⁺-PPase亚家族成员。另外,通过农杆菌转化获得了CmPP转基因烟草。对其子一代植株的抗旱分析发现,在干旱胁迫条件下CmPP转基因株系的干物质含量、总叶绿素含量和根系活力均下降,而其叶片MDA含量和电解质渗透率均升高,但相同胁迫下的变化程度都显著低于野生型烟草。这些结果表明CmPP基因的导入能够有效提高烟草的抗旱能力。

桂花类胡萝卜素异构酶基因的克隆及表达分析

张超, 刘玉成, 王艺光, 付建新, 赵宏波

2017, 33(6):  89-96.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1163

摘要 ( 250 )   HTML   PDF (6188KB) ( 421 )  

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利用已构建的桂花‘堰虹桂’花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对1个桂花类胡萝卜素异构酶基因（OfCRTISO）的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析表明OfCRTISO基因含有长为1 842 bp的开放读码框,编码613个氨基酸残基。桂花OfCRTISO与已知胡麻科和茄科植物的CRTISO序列相似性最高,系统进化树分析发现OfCRTISO与芝麻CRTISO（XP_011077785）亲缘关系最近,聚为同一小支。表达分析发现,OfCRTISO基因在桂花‘堰虹桂’花蕾前期花序中的表达量极低,花蕾后期其表达量逐渐增加,初开期达到高峰,而盛开期时,其表达量显著下降。对桂花不同花色品种花瓣中OfCRTISO基因的表达分析表明,桂花初开期OfCRTISO基因的表达量可能影响盛开期各品种花瓣中类胡萝卜素的积累。

稻瘟病菌机械敏感性离子通道的鉴定及功能分析

陶尚琨, 王国梁, 刘文德

2017, 33(6):  97-103.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1209

摘要 ( 302 )   HTML   PDF (1624KB) ( 315 )  

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稻瘟病是水稻上危害最为严重的病害之一,其病原菌为子囊菌门稻瘟病菌。作为模式真菌,研究稻瘟病菌的致病机理不仅能为其病害防治提供理论依据,也给其它病原真菌提供借鉴意义。离子通道是细胞内外物质交换的窗口,具有成为防治靶标的潜力,对病害防控具有重要意义。机械敏感性离子通道是一类通过感受细胞膜张力变化来实现胞内外机械信号转导的离子通道。运用生物信息学鉴定了稻瘟病菌的3条机械敏感性离子通道蛋白MoMsc1,MoMid1和MoYvc1,进化分析表明它们在真菌里具有保守性。还对稻瘟病菌的小电导率机械敏感性离子通道蛋白MoMsc1进行了功能分析,该基因沉默并未影响其生长发育、外界胁迫、细胞壁完整性及致病力。

稻瘟病菌不同生长期蛋白精氨酸甲基转移酶基因的表达分析

吴立叶, 王国梁, 刘文德

2017, 33(6):  104-111.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1142

摘要 ( 421 )   HTML   PDF (2406KB) ( 432 )  

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精氨酸甲基化是一种广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰,其主要过程为蛋白质精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferases,PRMTs）催化S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine,SAM）提供的甲基基团转移到蛋白质精氨酸侧链胍基基团上。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染水稻引起的稻瘟病,每年均会为水稻生产造成严重损失。近年来稻瘟病菌和水稻已成为研究植物病原真菌与寄主植物互作的理想模式生物。生物信息学分析表明,稻瘟病菌中含有4个PRMT基因（MoPRMT1-4）,经蛋白序列比对分析发现,它们均含有保守的甲基转移酶结构域;构建系统发育树,表明稻瘟病菌PRMTs在丝状真菌中高度保守;通过提取稻瘟病菌在不同生长和侵染时期的mRNA,利用实时荧光定量PCR技术,分析稻瘟病菌PRMTs基因的表达谱,发现MoPRMT1在侵染后24 h表达量达到最高峰,而其他阶段表达水平基本一致;MoPRMT2与其他3个基因相比,各阶段表达量均较低,且各时期表达水平也没有明显变化;MoPRMT3在芽管和附着胞发育阶段表达量较高,MoPRMT3和MoPRMT4在成熟附着胞时期表达量均达到最高,MoPRMT4在侵染后42 h也出现表达峰值。这些数据表明PRMTs基因对于稻瘟病菌的侵染致病可能起重要调控作用。

四种芽孢杆菌对蒜薹灰葡萄孢霉抑制作用的时效性研究

魏倩, 张娜, 张平, 李明刚, 阎瑞香

2017, 33(6):  112-120.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1216

摘要 ( 245 )   HTML   PDF (2994KB) ( 414 )  

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旨在对保存的4种芽孢杆菌菌株种属水平做初步鉴定并研究其在离体条件下对蒜薹灰葡萄孢霉的抑制作用以及活体条件下对蒜薹保鲜的时效性。采用平板对峙法和菌丝生长法进行离体实验,采用有伤接种法在不同时间段进行预防和治疗活体实验。结果表明,离体条件下,与对照相比,4种芽孢杆菌对灰葡萄孢霉菌落扩展和菌丝体生长都有显著的抑制作用且效果HB-2>B579﹥B1﹥B001（P<0.05）。20℃活体实验中,4种芽孢杆菌的预防处理均能较好地控制蒜薹灰葡萄孢霉病斑扩展,且效果好于治疗处理,但是不同芽孢杆菌最佳的预防时间有所不同。其中,HB-2和B579预防处理能较好地保持蒜薹的可溶性固形物、维生素C以及可滴定酸含量。综合来说,芽孢杆菌HB-2比其他3种芽孢杆菌能更有效地预防蒜薹灰霉病。

内生链霉菌SSD49的抑菌活性和防病促生效果

葛优优, 刘晓瑜, 窦桂铭, 马玉超

2017, 33(6):  121-127.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1121

摘要 ( 256 )   HTML   PDF (1669KB) ( 497 )  

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内生链霉菌SSD49分离自羊角拗的根部,对杨树溃疡病病原真菌具有很强的抑菌活性。为了研究该菌对各种病原菌的抑菌活性,促进植物生长的特征和作为生防菌剂的潜力,进行了平板对峙、组织培养和温室盆栽实验。结果显示,SSD49能够抑制板栗疫病菌、大豆核盘菌、辣椒疫霉、苹果轮纹病病原菌、杨树溃疡病细菌型病原菌、以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和白假丝酵母等多种植物病原菌和人类机会致病菌,并产生几丁质酶和31.56 mg/L的吲哚乙酸;接种SSD49孢子液的毛白杨组培苗、大豆、番茄和辣椒的株高、根长和地上部分干重及根干重分别提高了16.98%-41.82%、19.00%-55.85%、4.58%-70.87%和15.25%-126.06%;对大豆菌核病的防治效果达到88.24%。以上研究结果证明内生链霉菌SSD49在农林业的生物防治中具有潜在的应用价值,生防、促生机理有待进一步深入研究。

白藜芦醇对IgA大鼠肾组织TH2型炎性因子及血清CIC的影响

周敏

2017, 33(6):  128-133.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1065

摘要 ( 251 )   HTML   PDF (2528KB) ( 352 )  

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旨在考察白藜芦醇对IgA大鼠肾组织IL-4、IL-5、IL-13三种TH2型炎性因子及血清循环免疫复合物（CIC）的影响。将10只正常大鼠作为正常组,另40只采用胎牛血清白蛋白（BGG）处理9周制备4组IgA肾病（IgAN）大鼠模型,9周末进行白藜芦醇给药,并根据给药剂量的不同分别定义为模型组（未给药）、低剂量组（15 g生药/kg）、中剂量组（30 g生药/kg）、高剂量组（45 g生药/kg）,12周末剖杀,采用免疫荧光染色检验造模有效性,采用RT-PCR检测肾组织IL-4、IL-5、IL-13表达水平,采用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定血清CIC浓度。结果显示,造模成功;与正常组比较,模型组大鼠肾组织IL-4、IL-5、IL-13的相对表达水平极显著增高（P<0.001）,与模型组比较,低、中、高剂量组大鼠肾组织IL-4、IL-5、IL-13的相对表达水平均依次降低,各细胞因子指标组间两两比较均有统计学意义（P<0.01）;与正常组比较,模型组血清CIC浓度显著升高（P<0.01）,低、中、高剂量组均高于正常组,但与正常组比较均无统计学意义（P>0.05）,与模型组比较均显著更低（P<0.05）,并依次呈逐渐降低趋势。白藜芦醇可明显下调IgA大鼠肾组织总促炎性因子IL-5的表达,炎性反应减弱后抗炎性因子IL-4与IL-13也随之降低,同时白藜芦醇也能显著降低IgA大鼠血清CIC浓度。

大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达

姬菩忠, 赵兴绪, 秦文, 宋学文, 张勇, 赵红斌

2017, 33(6):  134-141.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1087

摘要 ( 269 )   HTML   PDF (3465KB) ( 289 )  

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克隆大鼠NeuroD2基因,旨在构建pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体并检测其在小鼠MSCs中的表达。采用RT-PCR技术克隆大鼠NeuroD2基因,分析该蛋白质结构、功能域、细胞定位及与其他物种同源性;构建pIRES2-AcGFP1-ND2表达载体并转染小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）;采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot技术检测重组质粒在小鼠MSCs中的表达。结果表明,大鼠NeuroD2基因CDS区全长1 149 bp,共编码382个氨基酸,属于bHLH家族,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构呈现近似“螺旋-环-螺旋（HLH）”结构,主要分布在细胞核,氨基酸序列与家鼠（99%）、罗猴（98%）、人（97.7%）同源性较高;Real-time PCR结果表明转染组NeuroD2基因表达量显著高于对照组（P<0.05）;免疫荧光及Western blot结果显示转染组NeuroD2蛋白表达量显著高于对照组（P<0.05）。成功克隆大鼠NeuroD2基因并构建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体。

猪Btnl5基因的克隆、表达分析及对NF-κB信号通路的调控作用

包琦, 赵凯, 段子渊

2017, 33(6):  142-148.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1151

摘要 ( 245 )   HTML   PDF (2624KB) ( 333 )  

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猪类嗜乳脂蛋白5（Btnl5）属于嗜乳脂蛋白家族,其同源蛋白多为免疫调节蛋白,为探索Btnl5的序列特征及其功能,利用反转录PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术对Btnl5基因cDNA全长进行克隆及序列分析,采用定量PCR技术检测Btnl5在猪不同组织中的表达丰度,利用报告基因法检测Btnl5对NF-κB信号通路的影响。克隆得到Btnl5基因cDNA全长共3 334 bp,包含1 680 bp的开放读码框,可编码长度为559个氨基酸残基的多肽链。蛋白结构预测表明Btnl5编码的蛋白含有信号肽、两段免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和B30.2结构域。定量PCR分析表明,在检测的11个组织中,Btnl5只在空肠中具有较高水平的表达。报告基因检测结果显示Btnl5对NF-κB信号通路有一定的抑制作用。研究结果说明,Btnl5可能通过抑制NF-κB信号通路参与调节肠道免疫。

梅花鹿胸腺素beta10基因真核表达载体的构建及鉴定

王佳雯, 高云鹏, 孙天霞, 刘美辰, 赵雨, 王思明

2017, 33(6):  149-154.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1000

摘要 ( 255 )   HTML   PDF (3712KB) ( 409 )  

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转录组测序发现Tβ10在鹿茸中高表达,为了研究Tβ10与鹿茸生长发育间的关系,构建Tβ10真核表达载体。使用Trizol法提取梅花鹿鹿茸总RNA,PCR技术特异性扩增梅花鹿Tβ10基因,利用酶切位点将目的片段插入真核表达载体VR1012构建表达质粒,通过Fugene^® 6将质粒瞬时转染到293T细胞中,使用Western blotting和免疫荧光方法检测目的基因的表达。结果发现克隆得到的梅花鹿Tβ10基因长度为129bp,编码42个氨基酸,成功构建真核表达载体VR1012- Tβ10-HA,转染后使用Western blotting方法检测到梅花鹿Tβ10在293T细胞中表达,免疫荧光方法证明梅花鹿Tβ10主要定位在细胞浆中。

四种新型农药对斑马鱼胚胎发育的毒性效应

吴玉琼, 陈莹, 胡永乐, 左正宏, 王重刚

2017, 33(6):  155-161.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0032

摘要 ( 478 )   HTML   PDF (2596KB) ( 662 )  

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为了研究4 种农药（腈苯唑、吡唑醚菌酯、恶霜灵、戊菌隆）单独及联合作用对斑马鱼胚胎发育的影响,设计7个实验组（空白组、溶剂组、4种农药单独暴露组及联合暴露组）对斑马鱼胚胎暴露72 h,结果显示,浓度50 ng/L的4种农药单独暴露导致心包囊和卵黄囊水肿比率、脊柱弯曲率均显著高于对照组;腈苯唑、恶霜灵及联合暴露导致斑马鱼仔鱼心率显著下降,出现显著的心律不齐;斑马鱼胚胎的Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性被显著诱导,而联合暴露表现出显著的抑制作用。结果说明,环境浓度的农药暴露对鱼类胚胎发育具有明显的毒性。

酵母抽提物对CHO细胞生长及抗体表达的影响

胡冬冬, 赵亮, 范里, 刘旭平, 邓献存, 缪仕伟, 谭文松

2017, 33(6):  162-169.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1020

摘要 ( 758 )   HTML   PDF (2745KB) ( 940 )  

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为了深入认识酵母抽提物在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生长及单克隆抗体表达过程中所发挥的作用,综合考察了传代培养和批式培养过程中,不同浓度酵母抽提物条件下CHO细胞生长、抗体表达以及营养物代谢的情况。传代培养过程中,低浓度（1 g/L）的酵母抽提物能够显著促进CHO细胞的生长,高浓度（5-10 g/L）的酵母抽提物则会显著抑制CHO细胞的生长;同时,传代过程中添加酵母抽提物不会影响种子细胞在批式培养中的表现。批式培养过程中,抗体比生成速率随酵母抽提物浓度的提高而升高,浓度为10 g/L时获得最高抗体产量。通过采用细胞生长阶段低浓度、产物表达阶段高浓度的添加策略,酵母抽提物在动物细胞培养过程中可发挥巨大的应用价值。

新疆栽培一枝蒿粗多糖对OVA抗体水平及T淋巴细胞亚群的影响

王丹阳, 赵淑述, 康亚玲, 罗小龙, 谭亚超, 张爱莲, 张富春

2017, 33(6):  170-175.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0964

摘要 ( 228 )   HTML   PDF (2494KB) ( 326 )  

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初步探讨新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖（Un-deproteinization of cultivated Artemisia rupestris L. crude polysaccharides,UCARCP）对模式抗原卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）免疫小鼠后抗体水平以及T淋巴细胞亚群的影响。将UCARCP配伍OVA皮下免疫小鼠,初免1次,加强1次,铝佐剂为阳性对照组,间接ELISA法检测小鼠血清中IgG及亚类IgG₁、IgG_2a的抗体水平;流式细胞术检测脾细胞中CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞亚群的含量。结果显示,UCARCP能显著提高小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a的抗体水平（P<0.05）,且与铝佐剂组相比无显著性差异（P>0.05）;UCARCP能显著促进CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞亚群的含量（P<0.05）,与铝佐剂组相比没有显著差异（P>0.05）。新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖能显著促进模式抗原OVA免疫后小鼠的体液免疫水平和细胞免疫水平,与铝佐剂相当。

AM79 EPSPS蛋白的体外模拟胃肠液消化稳定性研究

王玉, 王建华, 刘允军

2017, 33(6):  176-181.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0072

摘要 ( 318 )   HTML   PDF (2575KB) ( 299 )  

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AM79 EPSPS基因是从草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我国自主知识产权的一个新型抗草甘膦基因,在转基因玉米中过表达能显著提高转基因玉米的草甘膦抗性,具有重要应用价值。为了评价AM79 EPSPS蛋白的食用安全性,本研究参考中华人民共和国国家标准,开展了AM79 EPSPS蛋白的消化稳定性研究。将AM79 EPSPS基因构建到原核表达载体pET-30a上,在大肠杆菌中表达了分子量为48.3 kD的可溶性AM79 EPSPS蛋白。通过Ni-NTA亲和层析方法纯化了AM79 EPSPS蛋白用于体外模拟胃肠液实验。结果表明,AM79 EPSPS蛋白在模拟胃肠液中均在15 s内即被消化,SDS-PAGE和Western蛋白免疫印迹均未检测到蛋白残留,表明AM79 EPSPS蛋白在模拟胃肠液体系中极易被消化。

蛋白激发子Hrip1互作蛋白的筛选及其原核表达

李书鹏, 杨秀芬, 袁京京, 邱德文

2017, 33(6):  182-189.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170001

摘要 ( 234 )   HTML   PDF (2933KB) ( 458 )  

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蛋白激发子Hrip1是从极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）中分离纯化出的一种新型超敏反应诱导蛋白,能激发烟草、拟南芥和水稻等多种植物的免疫防御反应,提高广谱抗病性。为了探究Hrip1诱导植物抗性反应的分子机制,以Hrip1为诱饵蛋白,通过酵母双杂交,在水稻cDNA文库中筛选Hrip1的互作蛋白。经回转验证和x-a-gal染色得到了一个Hrip1互作蛋白-CSN5。构建了互作蛋白CSN5的原核表达载体pGEX-6P-2-CSN5,并转化大肠杆菌表达菌株BL21。经IPTG诱导后获得了可溶性的融合表达蛋白,用GST亲和层析柱纯化获得单一条带的融合表达蛋白,并用Western blot鉴定了融合表达蛋白的正确性。研究结果为进一步鉴定Hrip1的互作蛋白及其功能奠定了基础。

溶藻弧菌中酯酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

赵书梅, 王霖慧, 唐嘉琦, 赵静宜

2017, 33(6):  190-196.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0028

摘要 ( 261 )   HTML   PDF (2025KB) ( 478 )  

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旨在克隆溶藻弧菌中的酯酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,研究酯酶酶学性质。从溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）7S-1的基因组DNA中克隆得到酯酶基因estZ,将该基因连接入表达载体pET28a,并在Escherichia coli BL21（DE3）中表达,对纯化后的酯酶蛋白进行酶学性质分析。结果显示,表达菌株E. coli BL21-28a-estZ可高表达具有活性的酯酶,在18℃添加0.4 mmol/L IPTG的LB培养基中诱导22 h,酯酶的比酶活可达5.42 U/μg;重组表达的酯酶EstZ最适反应温度为25℃,最适pH为9.0。10 mmol/L Na⁺和Mg²⁺对其有较好的激活作用;Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺对该酶活性有较大抑制。该酶对多种有机溶剂及表面活性剂具有一定的耐受性,同时具有较高的耐盐性。对溶藻弧菌中的酯酶进行研究为该菌更好的应用于生物脱墨技术奠定了理论基础。

利用增强型绿色荧光蛋白研究不同启动子在乳酸克鲁维酵母中的功能

孙海烨, 张梁, 李由然, 顾正华, 丁重阳, 石贵阳

2017, 33(6):  197-206.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0049

摘要 ( 364 )   HTML   PDF (2636KB) ( 736 )  

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以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因评价不同启动子在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中的转录功能,寻找高效表达外源蛋白的启动子。以改造后载体pKLAC1*为基础,PCR克隆来源于K. lactis、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和Spathaspora passalidarum中7个不同的启动子,采用重叠延伸PCR分别与egfp融合后插入pKLAC1*,Bst XI线性化重组表达载体后电转化K. lactis GG799获得重组菌,利用特异性引物PCR扩增法快速筛选获得不同启动子调控下的单拷贝整合重组菌,通过定性和定量分析绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,比较不同启动子的转录活性。荧光显微镜观察结果表明,K. lactis来源的pKladh4、pKlmal22,S. cerevisiae来源的pScgal7、pScgpd1,S. passalidarum来源的pSpmal1、pSpmal6、pSpgal1均成功调控EGFP的表达。荧光分光光度计定量测定结果表明,重组菌在pKladh4、pScgal7、pScgpd1调控下荧光强度分别为2.82、2.92和4.74,且在相应的诱导条件下转录能力分别提高了13%、57%和22%,均高于当前应用最广泛的强启动子pKllac4（荧光强度为2.13）。探究了不同来源启动子在K. lactis中的功能,pKladh4、pScgal7、pScgpd1具有高效起始转录能力,其中pScgpd1在K. lactis中的应用为首次报道。

嗜热子囊菌JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A在毕赤酵母中的表达

张多多, 郑菲, 罗会颖, 李中媛, 罗学刚

2017, 33(6):  207-213.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1083

摘要 ( 201 )   HTML   PDF (1692KB) ( 362 )  

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从嗜热子囊菌（Thermoascus crustaceus）JCM12803克隆α-半乳糖苷酶基因,并对其酶学性质进行系统的研究,旨为获得工业应用性质优良的α-半乳糖苷酶。通过RT-PCR方法从T. crustaceus JCM12803中克隆α-半乳糖苷酶基因序列,并对其酶学性质进行了系统的分析。结果显示,tcgal27A属于糖苷水解酶27家族,基因全长1 918 bp,含有4个内含子,cDNA全长1 419 bp,编码472个氨基酸,预测tcgal27A N端含有24个氨基酸为其可能的信号肽。将TCGal27A在毕赤酵母中成功地进行了表达,所获得的重组TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）及宽泛的底物特异性,对蜜二糖（14.4 U/mg）、棉子糖（9.1 U/mg）、角豆胶（3.6 U/mg）、魔芋粉（1.6 U/mg）、瓜尔豆胶（1.3 U/mg）、水苏糖（0.7 U/mg）都有着不同程度的降解作用。以pNPG为底物时的Km值为1.6 mol/mL,Vmax为536.8 μmoL/（min·mg）。TCGal27A的最适作用pH为4.5,最适温度为65℃,50℃处理1 h之后酶活力还能保持86.0%。这些结果表明耐高温TCGal27A性质优良,可添加到饲料中,在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潜在应用 价值。

酮还原酶中立体选择性还原位点的突变及其产物分析

李凌凌, 吕早生, 左振宇, 杨忠华, 刘曜宁, 宋采薇

2017, 33(6):  214-222.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1195

摘要 ( 271 )   HTML   PDF (3877KB) ( 348 )  

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为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶中酮还原酶（EryKR）的LDD模式序列是否为控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点,构建了分别异源表达聚酮合成酶模块1的酮还原酶（EryKR1）、模块2的酮还原酶（EryKR2）、LDD残基替换为PQQ（LDD→PQQ）的EryKR1及PQQ替换为LDD（PQQ→LDD）的EryKR2的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（pET28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导后4个重组菌中都表达出相应的酮还原酶。粗酶液的比酶活分别为1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用气相色谱分别检测4个重组菌还原2-甲基环己酮体系中产物的立体结构,结果显示与野生型EryKR1的还原产物以顺式-2-甲基环己醇为主不同,LDD→PQQ的突变型EryKR1催化2-甲基环己酮的还原产物主要为反式-2-甲基环己醇,而PQQ→LDD的突变型EryKR2的主要还原产物也由野生型EryKR2的反式-2-甲基环己醇转变成顺式-2-甲基环己醇,证实了LDD模式序列确实为酶中控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点。

硅羟基磁珠的制备及全基因组DNA提取优化

李海洋, 王飞, 雷红涛, 张璇, 陈珂

2017, 33(6):  223-229.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1045

摘要 ( 727 )   HTML   PDF (3083KB) ( 930 )  

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旨在制备硅羟基功能化纳米磁珠与核酸提取试剂,并对提取过程进行优化。采用溶剂热法制备硅羟基功能化纳米磁珠,并用表面化学修饰法在磁珠表面包裹SiO₂;在自制磁珠提取过程中分别对比缓冲液浓度、裂解液浓度、磁珠量以及洗脱温度等因素对DNA提取效率的影响,使用紫外分光光度计定量测定和琼脂糖凝胶电泳定性验证,并与商品化磁珠试剂盒提取效果进行对比。结果显示,通过水热法成功合成了粒径在200 nm左右的Fe₃O₄@SiO₂磁珠,当磁珠量为1.5 mg,裂解液为含5 mol/L的盐酸胍溶液（pH4.9）,缓冲液体系为含60%无水乙醇的60 mmol/L盐酸胍缓冲液（pH7.5）,洗脱温度为65℃时,所提取的核酸效果达到最优,且4个因素对浓度的影响均存在统计学差异（P<0.05）。利用自制磁珠和试剂体系可高效的完成全血中全基因组DNA的提取,且优于商业化试剂盒。

雌酮胁迫农田土壤微生物群落结构变化研究

田琳, 张珣

2017, 33(6):  230-236.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0861

摘要 ( 288 )   HTML   PDF (1985KB) ( 306 )  

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雌酮是具有雌效应的天然类固醇雌激素之一,具有高毒性、难降解的特性,可通过食物链蓄积于体内,威胁人类和动物的健康。使用PCR-DGGE技术分析雌酮胁迫下农田土壤微生物群落结构变化。结果表明,雌酮浓度越高,对微生物种群的影响越深,种群的亲缘关系也就越复杂。在雌酮浓度为500 ng/kg至2 000 ng/kg时,微生物群落多样性随着E1浓度的增加而减小,超过某一值时其多样性则会迅速增加,继续增大E1浓度,多样性增加趋势则逐渐变缓。雌酮在微生物作用下可以转变为雌二醇、雌三醇和结合态的E1-3G,这种相互转变也会给微生物菌群多样性带来更加复杂的变化。

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2017, 33(6):  300. 

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2017, 33(6):  400. 

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2017, 33(6):  500. 

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