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2022年 第38卷 第3期    刊出日期：2022-03-26

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研究报告

拟南芥F-box蛋白FKF1与转录因子FUL互作调控开花研究

周娟, 阎晋东, 李新梅, 刘雪晴, 赵强, 赵小英

2022, 38(3):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0499

摘要 ( 748 )   HTML ( 47)   PDF (2611KB) ( 974 )  

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F-box蛋白FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1（FKF1）参与调控拟南芥光周期开花,但其分子机制尚不完全清楚。本研究通过体内和体外实验,证明FKF1与转录因子FRUITFULL（FUL）相互作用。qRT-PCR和Western blot结果显示,FKF1正调节FUL的转录水平,但不影响FUL蛋白的稳定性。遗传分析结果显示,35S-FKF1-Myc / ful-8双突变体的开花表型以及开花基因FLOWERING LOCUS T（FT）的转录水平与ful-8突变体相一致。研究结果表明FKF1可通过与FUL互作,在FUL的上游促进FT表达,进而促进开花。

水稻响应盐胁迫关键转录因子的鉴定

张斌, 杨昕霞

2022, 38(3):  9-15.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0802

摘要 ( 796 )   HTML ( 54)   PDF (5148KB) ( 635 )  

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盐胁迫是影响水稻生产的重要非生物胁迫之一。本研究以盐胁迫条件下的水稻转录组数据为材料,通过HTSeq和DESeq软件分析转录因子在转录组水平上的表达变化。主要结果如下：水稻在盐胁迫1、3和6 h三个时间点共有26个相同的差异表达转录因子,通过蛋白互作筛选出14个基因组成的重要模块;重要模块基因GO分析主要富集在ATP结合功能、对胁迫反应的过程以及细胞质膜囊泡组分上,KEGG分析主要富集在内质网蛋白质加工和内吞作用的通路上;同时鉴定出受盐胁迫诱导表达的关键热激转录因子基因Os03g0745000和Os06g0553100。推测这两个基因可能通过调控HSP70基因的转录表达,影响蛋白质折叠和组装,从而在水稻响应盐胁迫的过程中发挥作用。该研究为后续进行水稻遗传改良提供了候选基因,对进一步认识耐盐机制提供科学启示。

水稻不育系稻粒黑粉病抗性QTL的定位

杨益善, 孙平勇, 余木兰

2022, 38(3):  16-21.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0934

摘要 ( 500 )   HTML ( 12)   PDF (2384KB) ( 398 )  

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为了定位稻粒黑粉病抗性基因,建立水稻抗稻粒黑粉病分子育种技术体系。以对稻粒黑粉病抗性较强的光温敏不育系W9593S和易感稻粒黑粉病、与W9593S不育基因等位的光温敏不育系培矮64S为亲本,通过杂交和多年自交,构建了由183个高世代稳定不育系组成的重组自交系遗传群体。以这个重组自交系遗传群体为材料,利用200个多态性SNP分子标记,通过复合区间作图对稻粒黑粉病抗性QTL进行定位。结果定位到5个稻粒黑粉病抗性QTL,分布在4条染色体上,表型贡献率为7.26%-13.64%,其中,qRRKS-11和qRRKS-8的表型贡献率较大,分别为13.64%和12.07%,定位区间的遗传距离分别为0.9和1.4 cM。水稻对稻粒黑粉病的抗性表现为数量性状遗传,通过精细定位和克隆主效QTL,可以实现抗稻粒黑粉病不育系的分子标记辅助育种。

茶树CsCML24的克隆及表达分析

康芮, 刘春晖, 陈思文, 赵仁亮, 周琼琼

2022, 38(3):  22-30.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0797

摘要 ( 563 )   HTML ( 17)   PDF (5295KB) ( 278 )  

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类钙调素（calmodulin-like protein,CML）是植物体内一类钙受体蛋白,介导Ca²⁺与下游靶蛋白的相互作用,在植物抗逆反应中发挥重要作用。探究茶树中CML蛋白在逆境胁迫中的功能,为进一步研究茶树CsCML24对逆境胁迫的响应机理提供理论依据。以龙井43一年生茶树扦插苗为材料,克隆得到类钙调蛋白基因CsCML24（GenBank登录号为MZ325391）,并进行了生物信息学分析。同时,利用实时荧光定量PCR技术分析茶树CsCML24组织表达特异性以及不同非生物胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsCML24的CDS长为480 bp,编码159个氨基酸。CsCML24为无信号肽及跨膜结构的稳定性亲水蛋白,含有EF-hand保守结构域,能与Ca²⁺结合。qRT-PCR表明,CsCML24在茶树各组织中均表达,在成熟叶的表达量显著高于其他组织,茎中表达量较低;该基因在低温（10℃）、干旱（20% PEG 6000）、高盐胁迫（200 mmol/L NaCl）和ABA（100 μmol/L）处理均能诱导表达,且在不同胁迫下表达差异显著,推测该基因可能通过ABA信号途径调节对低温和干旱的耐受性。

低温胁迫对柳杉不同无性系的影响及抗寒性评价

崔洁冰, 张萌, 张莹婷, 徐进

2022, 38(3):  31-40.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0615

摘要 ( 437 )   HTML ( 7)   PDF (2872KB) ( 786 )  

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通过分析柳杉不同无性系抗寒性的差异,评价柳杉不同无性系抗寒能力,为柳杉的引种栽培及抗寒育种提供理论依据。以生长一致的10个柳杉无性系的2年生枝条为试验材料,分别在4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃和-20℃目标低温下处理12 h,对其叶片的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及叶绿素荧光参数进行测定,结合主成分分析及隶属函数计算对测定的指标进行综合评价和抗寒性排序。结果表明,低温胁迫下随着温度逐渐降低,MDA含量在一定温度范围内具有一定的波动性,但总体上呈现先上升后下降再上升的趋势;SOD活性在低温初期先出现短暂的下降后经抗寒锻炼呈现出上升又下降的趋势;柳杉不同无性系PS II最大光化学效率（Fv/Fm）和PS II的实际光合量子产量（Y（II））表现出相似的变化趋势,其值在0℃达到最高,0℃之后持续降低;光化学淬灭系数（qP）在低温初期无明显变化,0℃后随着低温胁迫的加剧而降低。柳杉不同无性系抗寒性具有显著差异,其中57#、68#和32#无性系抗寒性较强,3#、25#和42#无性系抗寒性较弱。

茉莉花萜类合成酶基因的转录组鉴定及响应外源激素的表达研究

洪雅萍, 陈雪津, 王鹏杰, 谷梦雅, 高婷, 叶乃兴

2022, 38(3):  41-49.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0716

摘要 ( 445 )   HTML ( 17)   PDF (3964KB) ( 396 )  

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探究萜类合成酶（Terpenoid synthase,TPS）在茉莉花萜类化合物合成中的作用及外源激素处理下的表达模式,为深入研究茉莉花TPS基因家族的功能及在外源激素胁迫中的作用奠定理论依据。以茉莉花转录组数据为基础,利用生物信息学方法对茉莉花TPS家族进行鉴定及分析,采用实时荧光定量分析茉莉花TPS家族在茉莉花不同组织中及不同激素处理下的表达模式。结果显示,茉莉花TPS家族含有8个同时具有Terpene_synthase和Terpene_synthase_C结构域的家族成员,分别命名为JsTPS1-JsTPS8。茉莉花TPS成员的蛋白长度为163-844个氨基酸;分子量为19 103.6-96 887.4 kD,主要定位于细胞质和叶绿体中。系统进化树显示茉莉花TPS基因家族可以分为4个亚家族（a、b、e/f、g）;qRT-PCR结果显示,JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5、JsTPS7基因在花瓣中高表达;经IAA、GA、SA和MeJA处理后JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7的表达量受到不同程度的诱导表达。MeJA处理可显著诱导6个茉莉花TPS基因的上调表达,相对表达量最大值出现在4-9 h;4种激素的诱导作用由大到小分别为：MeJA>IAA>GA>SA。茉莉花含有8个TPS家族成员,茉莉花TPS基因主要在花瓣中高表达且与茉莉花香气形成关系密切,能够被IAA和MeJA诱导上调表达,GA和SA可能会抑制部分茉莉花TPS基因的表达。

三七细胞中共超表达FPS、SS对皂苷合成的影响

杨延, 于龙凤, 王绍梅, 李卫娜, 葛锋

2022, 38(3):  50-58.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0706

摘要 ( 331 )   HTML ( 6)   PDF (4469KB) ( 348 )  

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研究三七细胞中共超表达法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophasphate synthase,FPS）基因、鲨烯合酶（squalene synthase,SS）基因对三七细胞皂苷合成的影响。利用农杆菌EHA105将pCAMBIA1300S-FPS超表达载体转入已超表达SS的三七细胞内,双抗生素培养及基因组PCR筛选转双基因阳性株系、qRT-PCR测阳性株系中FPS、SS表达量,分光光度法及色谱法分别测总皂苷和单体皂苷量。在4株转FPS、SS细胞中,FPS的相对表达量均比两对照（未转基因细胞和仅转SS细胞）高,最高分别是未转基因对照的3.26倍和仅转SS对照的3.74倍;SS的相对表达量与仅转SS对照相比无显著差异,但均比转基因对照高;总皂苷含量均比两对照高,最高分别是未转基因对照的2.46倍和仅转SS对照的1.73倍;Re、Rh1、Rd和Rg1 单体皂苷量较两对照大多有不同幅度增加。在三七细胞中共超表达FPS、SS,可有效提高细胞中的总皂苷和部分单体皂苷量;此外,与仅超表达SS比较,共超表达FPS、SS能够进一步提高皂苷含量。

山西大豆根瘤菌的分离、鉴定及共生匹配性筛选

王晓丽, 秦杰, 王敏, 王利祥, 杜维俊

2022, 38(3):  59-68.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1315

摘要 ( 613 )   HTML ( 25)   PDF (5547KB) ( 267 )  

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山西作为大豆起源地之一,根瘤菌资源丰富。为了进一步挖掘山西省的大豆根瘤菌资源,筛选出与当地主栽大豆品种共生固氮效果好的根瘤菌。本实验在大同广灵、太原清徐、晋中太谷三地采集不同大豆品种的根瘤,经过多次划线,对分离纯化出的单菌落进行菌落形态、刚果红染色、BTB染色表型鉴定;16S rDNA、nodA和nifH基因型鉴定。利用BOX-PCR对所有根瘤菌进行电泳检测,去除条带完全一致的菌株,将目的条带不一致的菌在Bionumerics@7.5软件中聚类分析。选代表性菌株接种到晋大88号和科丰1号两个大豆材料,筛选匹配性好的菌株。共分离出203株菌,其中187株根瘤菌可以扩增出nodA、nifH基因,172株快生型根瘤菌,属于S. fredii;15株慢生型根瘤菌,分别属于B. diazoefficiens和 B. daqingense。BOX-PCR将85株条带不一致的根瘤菌分为四大类群,以70%为界限共分为16类。筛选出与晋大88号匹配性较好的根瘤菌GL11和GL43,其地上部分干重较接种USDA110分别增加38.5%、30.1%;根干重分别增加22.2%、27.8%;根瘤鲜重分别增加24.3%、41.5%;根瘤干重分别增加36.6%、31.0%。筛选出与科丰1号匹配性较好的根瘤菌TG37,其株高、地上干重、根干重、根瘤鲜重、根瘤干重和根瘤数较接种USDA110分别增加8.1%、15.0%、28.6%、27.3%、44.3%和60.6%。山西省根瘤菌资源丰富,种类多样,S. fredii为优势种,此外还分离出两类慢生型根瘤菌B. diazoefficiens和 B. daqingense,丰富了根瘤菌资源。筛选出共生匹配性好的根瘤菌为大豆生产实践奠定了物质基础和理论依据。

番茄果腐病拮抗菌的筛选及对番茄的防腐保鲜作用

张鸿雁, 林国莉, 李如莲, 纪晓琦

2022, 38(3):  69-78.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0521

摘要 ( 468 )   HTML ( 14)   PDF (2709KB) ( 380 )  

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从储藏期间番茄果实中分离到1株果腐病病原菌,为明确其分类地位,寻找合适的生防菌菌株,对其进行形态鉴定和系统发育分析,同时进行了拮抗链霉菌的筛选、鉴定和防腐保鲜作用研究。结果表明,导致番茄采后果腐病的病原菌Qyg16-2为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）;从番茄健康植株根际土壤筛选获得对Qyg16-2有良好拮抗作用的放线菌X13,经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列鉴定为桑氏链霉菌（Streptomyces sampsonii）。X13能抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长,显著提高番茄抗性酶多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,降低储藏番茄的腐烂指数,延缓果实硬度、可溶性固形物、可滴定酸及VC的降低。桑氏链霉菌（S. sampsonii）X13对病原菌葡萄座腔菌（B. dothidea）抑菌效果显著,对储藏番茄具有良好的防腐保鲜作用。

化肥减量配施中药源植物生长调节剂对当归质量和根际土壤细菌群落的影响

谢田朋, 柳娜, 刘越敏, 曲馨, 薄双琴, 景明

2022, 38(3):  79-91.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0467

摘要 ( 571 )   HTML ( 10)   PDF (3108KB) ( 386 )  

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为实现当归种植中“化肥农药减量增效”的绿色发展目标,探讨化肥减量配施一种中药源植物生长调节剂对当归质量和根际土壤细菌群落的影响,为该中药源调节剂改善当归质量的机理提供科学依据。以当归为研究对象,设置常规量化肥（CK）、中药源调节剂配施化肥（T1）、中药源调节剂配施80%化肥（T2）、中药源调节剂配施60%化肥（T3）4个处理,测定当归5个生长期的生长指标、病情指标、产量、根际土壤理化指标等,并通过16S rDNA扩增子测序分析根际土壤细菌群落的变化。结果表明：（1）生长早期T1组和T2组的当归根长、芦头直径、地下生物量显著高于其他组,成药期CK组当归根部蚜虫出现率、蚜虫密度、病情等级、发病率均高于其他组,且产量最低,T2组产量最高,比CK组增产2.61倍;（2）全生长期当归根际土壤盐分、铵态氮含量、有效钾含量在组间差异不显著。有机质含量仅在苗期的CK组中高于其他组,其他时期组间无差异。有效磷含量在全生长期组间变化较大,pH值随着化肥减量逐渐增加;（3）全生长期当归根际土壤细菌群落多样性在组间无差异,门水平上群落结构组成一致,变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）为优势菌群;（4）属水平优势菌群为黄杆菌属（Flavobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、拟杆菌属（Bacteroides）、MND1属、鞘氨醇杆菌属（Pedobacter）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、Ellin6067属、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、马赛菌属（Massilia）、鞘脂菌属（Sphingobium）、溶杆菌属（Lysobacter）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium属、Haliangium属和硝化螺旋菌属（Nitrospira）。其中假单胞菌属、柠檬酸杆菌属、Ellin6067属和马赛菌属丰度在当归不同生长时期存在组间显著差异,但仅有假单胞菌属丰度与当归根部生长指标显著正相关,与病情指标显著负相关,且CK组的假单胞菌属在早期和成药期较其他组显著降低。化肥减量配施中药源植物生长调节剂可促进当归早期根部生长,改善成药期根腐病病情,提高产量。该中药源调节剂通过增加当归根际土壤中假单胞菌属丰度促进当归质量的提升。

中药渣堆肥中解磷细菌的筛选、鉴定及其拮抗作用

胡珊, 梁卫驱, 黄皓, 徐匆, 罗华建, 胡楚维, 黄晓彦, 陈仕丽

2022, 38(3):  92-102.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0571

摘要 ( 490 )   HTML ( 19)   PDF (3974KB) ( 334 )  

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为开发新型、安全及高效的微生物菌肥,以堆肥2个月后的中药渣为试材,筛选解磷拮抗细菌。用有机磷细菌培养基初步筛选5株解磷细菌;采用溶磷圈法和磷钼蓝比色法测定初筛菌株的解磷作用,解磷作用最优的菌株是YP5;通过形态学特征观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定,确定菌株YP5为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。促生拮抗因子测定结果表明菌株YP5能分泌铁载体和大量胞外蛋白酶;药敏实验结果显示菌株YP5对诺氟沙星、氯霉素、庆大霉素、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感;分别采用平板对峙法和带毒培养基法测定结果表明菌株 YP5发酵液和无菌滤液均对冬瓜根腐病等9种植物病原菌有良好的拮抗作用,抑菌率最高达80%以上。高效液相色谱测定菌株YP5在28℃、KB培养基中抗菌代谢物申嗪霉素的产量最高,为17.73 mg/L。

产生促生挥发性物质的潜在PGPR菌株筛选及其促生特性研究

高亚慧, 姜明国, 丰景, 周桂

2022, 38(3):  103-112.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0619

摘要 ( 503 )   HTML ( 17)   PDF (4761KB) ( 1211 )  

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旨在筛选出能产生促进植物生长的挥发性有机化合物（volatile organic compounds,VOCs）的潜在植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）,考察其VOCs对植物的促生作用及其它促生功能,为研发微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以本实验室从海洋样品中分离保存的48株功能菌为供试菌株,通过二分隔平板实验、VOCs盆栽实验进行筛选,结合菌株的16S rRNA进行鉴定,通过气相色谱-质谱联用的方法（Gas Chromatography-Mass,GC-MS）对菌株所产VOCs成分进行分析。通过平板活性实验对细菌的固氮,溶磷及产IAA进行活性检测。研究结果显示：筛选得到1株潜在PGPR - GX14001,其所产生的VOCs对本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和上海青（Brassica chinensis L.）均表现出明显的促生作用,菌株经16S rRNA鉴定为橙色微杆菌（Microbacterium aurantiacum）。经GC-MS对其VOCs成分分析,共得到7种特异性化合物。经平板活性检测,GX14001具有较强的溶有机/无机磷活性和一般固氮活性,而其产IAA能力较弱,为1.737 μg/mL。PGPR可通过不同的促生机制对植物表现出促生作用,研究结果表明GX14001所产VOCs对植物有明显促生作用,其他方面的促生活性并不高,两者之间不存在较高的正相关性,说明其最主要的促生作用是通过所产生的VOCs获得的。

白蚁菌圃中木质素降解菌的筛选及降解效果

韩东晶, 王志花, 周宁, 刘国庆, 杨少华, 汪文君

2022, 38(3):  113-120.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0626

摘要 ( 453 )   HTML ( 12)   PDF (5813KB) ( 314 )  

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为了选出能够有效降解木质素的菌株,以废弃的白蚁巢为来源进行筛选,并以无氮培养基、碱木质素培养基、苯胺蓝培养基和愈创木酚培养基进行复筛。对筛选出的菌株进行16S rRNA鉴定以及形态学分析。通过扫描电镜、傅里叶红外光谱对降解前后的碱木质素进行降解特性的解析。结果筛选出一株具有木质素降解能力的细菌经鉴定并命名为R.ornithinolytica RS-1,以碱木质素为底物发酵一周,木质素降解率在前3 d最高达到24.21%,同时3种木质素降解酶过氧化物酶（Lip）、锰过氧化物酶（Mnp）、漆酶（Lac）的酶活也达到最高,分别为177.42 U/L、1466.67 U/L、6.94 U/L。扫描电镜和红外光谱发现经菌处理后结构有明显变化,说明该菌可以作为木质素降解的有效菌株。

香茅醇假单胞菌SJTE-3的短链脱氢酶SDR-X1的克隆及酶性质测定

付雅丽, 彭万里, 林双君, 邓子新, 梁如冰

2022, 38(3):  121-129.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0471

摘要 ( 365 )   HTML ( 10)   PDF (5040KB) ( 315 )  

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香茅醇假单胞菌SJTE-3能够以17β-雌二醇为唯一碳源并将其高效降解,但其催化雌二醇转化的关键酶仍不明确。本文鉴定了该菌株中降解雌二醇的短链脱氢酶SDR-X1（WP_043267487.1）,并对其功能进行了研究。首先利用荧光定量PCR,检测了不同碳源条件下基因sdr-x1的转录水平;克隆基因sdr-x1,在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,利用亲和层析纯化获得了重组蛋白SDR-X1;体外检测了重组蛋白SDR-X1的催化活性与酶学性质,并利用高效液相色谱鉴定了其转化17β-雌二醇的产物。蛋白SDR-X1可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对显示蛋白SDR-X1含有短链脱氢酶的保守基序与氨基酸。该酶以NAD⁺为辅因子,将17β-雌二醇氧化为雌酮;其K_m值为（0.039 86±0.004 061）mmol/L,V_max值为（3.168±0.135）mmol/L/min/mg,可在15 min内转化61.75%以上的雌二醇。该酶对温度具有一定耐受性,最佳反应温度为50℃,偏碱性pH可促进其酶促反应。不同二价金属离子对该酶活性具有不同的影响,Mg²⁺、Mn²⁺和Ca²⁺可增强其酶活性。香茅醇假单胞菌SJTE-3中的SDR-X1可高效催化17β-雌二醇转化,参与该菌株的雌激素降解过程,其功能研究将推进细菌的雌激素代谢机制解析。

一株分泌型铁载体真菌分离鉴定及生物活性研究

邹雪峰, 李铭刚, 包玲风, 陈齐斌, 赵江源, 汪林, 濮永瑜, 郝大程, 张庆, 杨佩文

2022, 38(3):  130-138.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0394

摘要 ( 523 )   HTML ( 17)   PDF (5572KB) ( 904 )  

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从云南省国家自然保护区哀牢山原始森林土壤环境中分离1株分泌型铁载体真菌,并探讨了其对罹烟草青枯病土壤微生物生理生化功能的影响,为菌株的开发利用提供理论依据。稀释涂布法从土壤样品中分离纯化分泌型铁载体真菌菌株,形态学结合rDNA-ITS基因序列鉴定菌株分类学地位。铬天青S（chromeazurol S,CAS）液检测法结合全波段紫外光吸收法,判定铁载体化学结构类型,检测其活性。DNS比色法和Biolog-ECO分析法,分析菌株次生代谢产物对罹烟草青枯病土壤酶活性和微生物代谢的影响。结合形态学观察结果和序列对比分析鉴定该分泌型铁载体真菌为百岁兰曲霉（Aspergillus welwitschiae）;菌株分泌型铁载体的化学结构类型为羧酸盐型（carboxylates）,铁载体活性为78.79%。菌株次生代谢产物可显著提高土壤蔗糖酶和脲酶活性（P<0.05）,分别提高13.7%和14.46%;菌株次生代谢产物亦可显著提高碳源利用能力：平均颜色变化率（average well color development,AWCD）和多样性指数（Shannon指数和Richness指数）,分别提高86.15%、50.43%和66.67%。原始森林土壤环境贮藏铁载体微生物资源,利用菌株分泌型铁载体介导改善土壤微生物群落生理生化功能是实施土壤生态系统的优化管理的重要技术手段。

美洲大蠊肠道产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的筛选及鉴定

唐彬, 刘文彬, 李小波, 王宁, 金小宝

2022, 38(3):  139-148.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0620

摘要 ( 332 )   HTML ( 6)   PDF (4955KB) ( 327 )  

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旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株。在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率。结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶。高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis。WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52%。美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9（GenBank Accession：MZ411692）具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础。

家蝇抗菌肽MDC对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌稳定性研究

王子琰, 王建, 张伦, 桂水清, 卢雪梅

2022, 38(3):  149-156.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0847

摘要 ( 417 )   HTML ( 5)   PDF (5951KB) ( 355 )  

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以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）作为研究对象,探讨家蝇抗菌肽（Musca domestica cecropin,MDC）在不同条件下的抑菌稳定性。采用牛津杯法研究pH值、温度、光照、蛋白酶、金属离子、表面活性剂及有机试剂对MDC抑菌活性（抑菌圈大小）的影响。在酸性条件下MDC的抑菌活性稍有下降,保持在85%左右,但在碱性条件下的抑菌活性无明显改变,稳定性较好。经低温和高温处理后,抑菌活性无显著差异。MDC在黑暗、正常光及紫外线照射处理30 min,其抑菌活性仍保持稳定。MDC对胰蛋白酶敏感,抑菌活性完全消失,而对胃蛋白酶具有良好的稳定性。MDC对Ca²⁺、K⁺有良好的稳定性,但对Mg²⁺敏感,在Fe³⁺作用下其抑菌活性较对照组有所升高（P<0.05）。表面活性剂和有机试剂处理MDC后,其抑菌活性均明显降低。家蝇抗菌肽MDC能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌生长繁殖,其活性几乎不受pH值,温度和光照变化、胃蛋白酶和某些金属离子的影响,且Fe³⁺能够协同增强MDC的抑菌活性,但Mg²⁺、表面活性剂、有机试剂以及胰蛋白酶水解作用可分别使其抑菌活性部分或完全丧失。

新型冠状病毒S1蛋白的表达及活性鉴定

汪巧菊, 胡雨萌, 温亚亚, 宋丽, 孟闯, 潘志明, 焦新安

2022, 38(3):  157-163.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1076

摘要 ( 572 )   HTML ( 14)   PDF (3382KB) ( 426 )  

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旨在获得具有免疫活性的SARS-CoV-2 S1蛋白,为COVID-19的免疫预防及临床诊断提供较好的候选抗原。该研究利用PCR技术扩增出刺突蛋白（Spike,S）的S1亚基序列,通过同源重组法将目的片段克隆至冷休克表达载体pCold I,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞内诱导表达S1蛋白,经Ni²⁺柱亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白的表达情况。结果表明,已成功表达含His标签的S1蛋白,并且已获得浓度和纯度较高、能与S1多克隆抗体反应的目的蛋白。此外,蛋白刺激细胞的结果表明,原核表达的S1蛋白免疫原性良好,能诱导小鼠巨噬细胞上调表达多种细胞因子和趋化因子,促进RAW264.7细胞产生免疫反应。综上,该研究成功构建了pCold I-S1重组质粒,获得了SARS-CoV-2的良好候选抗原S1蛋白。

Vps28基因敲除小鼠模型的构建及其对泌乳和免疫性状影响的研究

丁亚群, 丁宁, 谢深民, 黄梦娜, 张昱, 张勤, 姜力

2022, 38(3):  164-172.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0446

摘要 ( 409 )   HTML ( 10)   PDF (4401KB) ( 354 )  

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尽管基于QTL定位和关联分析研究挖掘了许多奶牛产奶性状候选功能基因,然而仅有少数几个基因经过体内外的功能验证。本课题组前期全基因组关联分析（GWAS）研究结果表明Vps28基因与奶牛产奶性状表型显著相关,并在奶牛乳腺组织中特异性高表达。为了深入了解该基因对泌乳性状的作用和功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了Vps28基因敲除小鼠,对其进行体内功能研究。研究结果显示Vps28基因敲除纯合型小鼠（Vps28-/-）极可能导致胚胎早期死亡,故只获得杂合型基因敲除小鼠（Vps28+/-）。敲除小鼠模型构建成功后,检测乳腺组织和脾脏组织中Vps28基因mRNA和蛋白的表达,结果显示与野生型小鼠（Vps28+/+）相比,Vps28+/-杂合型小鼠Vps28的mRNA和蛋白表达量均显著下降。进一步对母鼠的泌乳量、乳房形态和血常规进行检测,发现Vps28敲除母鼠的泌乳量下降,乳头明显凹陷,且血常规中白细胞数量、中性粒细胞数量、淋巴细胞数量和中间细胞数量显著低于野生型小鼠,推测Vps28基因不但影响泌乳,而且影响相关免疫性状。

基于CRISPR/Cas9技术构建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

燕炯, 冯晨毅, 高学坤, 许祥, 杨佳敏, 陈朝阳

2022, 38(3):  173-180.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0647

摘要 ( 426 )   HTML ( 7)   PDF (4215KB) ( 225 )  

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利用CRISPR/Cas9技术构建纯合围脂滴蛋白（Plin1）基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA并构建表达载体,体外转录获得sgRNA后与Cas9蛋白混合,显微注射至小鼠受精卵中并进行胚胎移植。出生小鼠经测序及PCR基因型鉴定获得F₀代阳性小鼠;令F₀代小鼠与野生型小鼠杂交,获得F₁代杂合子小鼠;通过F₁代杂合小鼠近交,获得F₂代纯合子小鼠模型。常规饲喂同窝别Plin1基因敲除纯合小鼠、杂合小鼠和野生型小鼠,并测量小鼠体重、身长等体格参数;定量实时聚合酶链反应（Q-RT-PCR）和蛋白质印迹（WB）分别检测每个组织中Plin1基因在mRNA和蛋白质水平的表达。敲除了小鼠Plin1基因741 bp的片段（包含了2号外显子在内）;Plin1基因敲除小鼠PLIN1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P < 0.05）;常规喂养4周后,相比于野生型及杂合型小鼠,纯合型Plin1基因敲除小鼠体重显著降低（P < 0.05）。成功构建了Plin1基因敲除小鼠模型;初步表型分析发现,Plin1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比较为瘦弱。

乳双歧杆菌V9对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠的改善作用

钟明月, 刘春妍, 颜妍, 张晓慧, 原海升, 徐国全, 张和平, 王玉珍

2022, 38(3):  181-187.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0630

摘要 ( 853 )   HTML ( 9)   PDF (3852KB) ( 298 )  

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研究乳双歧杆菌V9（V9）对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）大鼠脂代谢、肠道损伤的改善作用,并探讨其作用机制。雄性Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组（Control）、高脂饮食模型组（HFD）、黄连素阳性药物组（Berberine）、乳双歧杆菌V9治疗组（HFD/V9）和乳双歧杆菌V9对照组（V9）。除Control和V9给予普通维持饲料外,其他给予高脂饮食6周构建NAFLD模型。6周后,将高脂饮食替换为普通维持饲料,大鼠灌胃给予乳双歧杆菌V9（1×10⁹CFU/mL）或黄连素（50 mg/kg）。4周后,收集血液、肝脏以及结肠组织用于后续试验检测。与Control组相比,HFD组中肝脏非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）、肝脏脂肪酸合成酶（FAS）和肝脏脂肪酸结合蛋白1（Fabp1）mRNA的表达明显增高（P<0.01）;同时,肠道细胞因子白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、Toll-样受体2（TLR2）和Toll-样受体9（TLR9）的mRNA表达在HFD模型组中也明显升高（P<0.01）;相反地,紧密连接蛋白ZO-1和occludin mRNA的表达在HFD模型组中明显降低（P<0.01）。在给予乳双歧杆菌V9治疗以后,肝脏NEFA和TG含量明显降低（P<0.01）;肝脏FAS和Fabp1的mRNA表达也显著降低（P<0.01）。乳双歧杆菌V9和黄连素治疗后都降低了肠道IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR9的转录水平（P<0.01）。但是,提高了肠道紧密连接蛋白ZO-1和occludin mRNA的表达。Control组和V9组二者效应无显著差异（P<0.01）。HE染色显示,以上各组的结肠病理学无明显差异。益生乳双歧杆菌 V9 可以通过缓解脂代谢紊乱、降低肠道炎症反应并改善肠道黏膜屏障结构,从而改善高脂饮食诱导的 NAFLD。

AAV介导的RNAi对SARS-CoV-2 S基因表达的抑制作用

刘晓玫, 王东鑫, 张春, 魏双施

2022, 38(3):  188-193.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0596

摘要 ( 347 )   HTML ( 8)   PDF (2374KB) ( 289 )  

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旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒（rAAV）载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。

含非天然氨基酸定点突变的MLL3_SET蛋白表达与纯化

王小琴, 黄银萍, 王蔚倩, 吴萍, 全舒

2022, 38(3):  194-202.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0465

摘要 ( 454 )   HTML ( 8)   PDF (5775KB) ( 420 )  

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在组蛋白H3K4甲基转移酶MLL3的催化结构域（MLL3_SET）中定点引入非天然氨基酸N-炔丙基赖氨酸（N-propargyl-lysine,PrK）,表达、纯化该突变蛋白（MLL3_SET*）,并评估突变蛋白的酶活,为后续进一步利用单分子荧光共振能量转移技术（smFRET）表征MLL3的作用机制奠定基础。将MLL3_SET接入pET-28b（+）构建表达载体,通过MLL3_SET晶体结构分析选择N4905位点进行PrK的引入;对商业化菌株（C321. ΔA. exp）进行基因组改造以引入T7 RNA聚合酶基因,并在改造后的菌株中表达、纯化MLL3_SET*,最后测定MLL3_SET*的酶活性。结果表明,在构建的C321. ΔA. exp lacZ∷T7p07菌株中,pET28b-MLL3_SET* 在共转入aaRS-tRNA正交系统以及外源添加PrK后能够正常表达;通过Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析成功纯化出高纯度的MLL3_SET*蛋白;多酶级联反应结果显示,MLL3_SET*的酶活性比野生型蛋白低,但仍具有约43%的甲基转移酶活性。本研究成功实现了含PrK的MLL3_SET 蛋白的原核表达与纯化,突变蛋白保留了一定酶活性,为后续深入研究MLL3的分子机制奠定了基础。

综述与专论

WRKY对糖调控园艺作物冷适应的研究进展

潘英杰, 张颖, 武杞蔓, 李正青

2022, 38(3):  203-212.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0691

摘要 ( 511 )   HTML ( 20)   PDF (1153KB) ( 564 )  

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植物的糖既能参与细胞的碳和能量代谢,又能作为信号分子促进植株生长发育并参与调控植物对逆境胁迫的响应。目前诸多研究表明抗寒锻炼中可溶性糖的积累有助于保护植物抵御冻害,黄瓜等园艺作物的抗冷性在外源施糖后提高,但具体机制尚未明确。糖能够促进植株通过表观形态、生理生化及分子水平等方面对非生物逆境胁迫响应、调控植株的抗性。糖代谢过程与脱落酸（ABA）等植物激素的调控密切相关。WRKY作为ABA相关逆境应答信号通路中的核心转录因子,同是糖代谢调控机制中的重要因子,或许在响应冷胁迫的相关代谢机制中参与发挥着重要作用。综述了糖对园艺作物冷适应的响应及调控的分子机理,并分析讨论了WRKY家族对园艺植物糖调控冷适应效应响应的机理。

根际微生物对植物重金属胁迫的缓解作用及其机理研究进展

杨露, 辛建攀, 田如男

2022, 38(3):  213-225.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0811

摘要 ( 895 )   HTML ( 31)   PDF (1154KB) ( 1410 )  

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植物修复技术已成为重金属污染环境绿色修复的重要手段。在重金属胁迫下,根际微生物能够有效改善植物生长发育与生理代谢活动,并增强植物对重金属的吸收和富集能力。本文首先从根际微生物组成、根系-微生物相互作用两个方面进行阐述,并以此为基础分析植物根际促生菌、菌根真菌对植物重金属胁迫的缓解作用,同时从微生物、植物根系分泌物、植物乙烯合成、植物光合作用、植物抗氧化防御系统、植物水分与养分吸收、根际土壤微环境等方面论述了根际微生物缓解植物重金属胁迫的作用机制。最后,结合当前研究现状,提出进一步挖掘重金属胁迫下对植物生长有益的新菌种,探明重金属胁迫下植物根际区域不同微生物之间的相互作用,揭示重金属胁迫下植物根系-微生物互作体系的生理分子机制,以期为今后探索微生物辅助植物修复重金属污染环境的理论研究和实践提供指导。

单细胞转录组测序技术在动物上的应用研究

熊和丽, 沙茜, 刘韶娜, 相德才, 张斌, 赵智勇

2022, 38(3):  226-233.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0523

摘要 ( 842 )   HTML ( 36)   PDF (1109KB) ( 907 )  

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细胞是机体最基本的结构组成及功能单位,细胞类型和功能由其整个转录表达谱决定,通过单细胞转录组测序可以获得单个细胞转录表达谱,由此以高精度分辨率鉴定细胞类型、细胞状态以及稀有类型细胞,从而可以在单细胞水平分析细胞动态变化及细胞间的关系,深入解析驱动细胞变化及细胞异常背后的分子细胞机制。随着单细胞测序技术稳定性和测序通量的提高,以及测序成本的降低,其在发育生物学、肿瘤、免疫及疾病等领域被广泛应用,研究对象主要涉及人及模式生物,在动物上的应用研究相对较少。本文主要介绍单细胞转录组测序技术及其生物学应用并综述目前其在动物上的一些开创性研究,以期为今后更好的在动物上应用单细胞转录组测序提供方法参考。

大肠杆菌核糖核酸酶调控机制研究

孙曼銮, 葛赛, 卜佳, 朱壮彦

2022, 38(3):  234-245.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0341

摘要 ( 526 )   HTML ( 35)   PDF (4481KB) ( 359 )  

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核糖核酸酶参与体内多种RNA代谢反应,对细菌生理功能调节起重要作用。细菌需要进化出多种策略来对体内核糖核酸酶进行调节,以避免对RNA进行不必要地降解。目前对大肠杆菌核糖核酸酶调节机制的研究包括转录后调控、翻译后修饰、细胞定位及相关抑制剂等。本文系统性地阐述了大肠杆菌核糖核酸酶的分类、功能及其体内调控机制,总结了不同环境压力下大肠杆菌对自身核糖核酸酶进行适应性调节的响应机制及存在的问题。

环糊精葡萄糖基转移酶在天然产物糖基化修饰中的应用

张国宁, 冯婧娴, 杨颖博, 陈万生, 肖莹

2022, 38(3):  246-255.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0642

摘要 ( 576 )   HTML ( 17)   PDF (2982KB) ( 653 )  

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环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase）是一种可催化淀粉或多糖中α-1, 4键断裂并环化形成环糊精（cyclodextrins,CDs）的α-淀粉酶。CGTase在工业上主要用于制造环糊精,近年来利用其转糖基作用改造天然产物的性质取得了令人瞩目的研究进展,正成为CGTase应用颇有前途的发展方向。本文结合CGTase的来源、蛋白结构及催化机制等相关研究,重点介绍近年来CGTase在天然产物糖基化修饰中的应用,为CGTase在该领域的深入研究及应用提供参考。

技术与方法

基于宏基因组测序的植物叶表微生物富集及DNA提取方法

张雨函, 范熠, 李婷婷, 庞爽, 刘为, 白可喻, 张西美

2022, 38(3):  256-263.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0550

摘要 ( 613 )   HTML ( 27)   PDF (3127KB) ( 403 )  

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获得高质量的微生物基因组DNA是进行复杂微生物群落宏基因组学研究的基础和难点。植物叶表是一个微生物多样性丰富的复杂生态系统,这些微生物群落可以调节叶片功能性状,影响植物的适应性。深入了解叶表微生物群落的基本结构和功能原理,有助于在促进植物生长和植物保护方面发挥重要的应用价值。由于叶表严苛的环境,导致富集叶表微生物难度较大,严重限制了高质量叶表微生物基因组DNA的提取。基于现有DNA提取方法,加入表面活性剂Silwet L-77进行前处理,同时循环利用洗脱液,加强叶表微生物的富集,以提高叶表微生物的获取量。结合商业试剂盒方法进行提取得到高纯度、高浓度的基因组DNA。经过质量控制和建库测序验证,DNA质量达到宏基组建库的要求。通过此方法可以提高叶表微生物分离和收集效率的方法,提高叶表微生物DNA提取成功率,为应用高通量测序技术研究叶表微生物组成和其他植物分子生物学研究提供参考。

基于大肠埃希菌 O157∶H7的荧光定量冻干检测试剂盒的研制

粟元, 朱龙佼, 曹继娟, 刘建龙, 许文涛

2022, 38(3):  264-275.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0768

摘要 ( 448 )   HTML ( 5)   PDF (6839KB) ( 309 )  

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大肠埃希菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7,E. coli O157∶H7）作为一种食源性致病菌,其分布广泛、危害性大。为了研制一种基于E. coli O157∶H7的既能实现快速、简单和灵敏检测,又能够实现常温储存及运输的试剂盒,本研究利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR）技术,结合真空冷冻干燥技术,研制了保留核酸检测性能、易于常温储存及运输、减少气溶胶污染的E. coli O157∶H7荧光定量冻干检测试剂盒。研制的试剂盒采用冻干技术保留了核酸扩增试剂的检测性能,复水后,在Taq DNA聚合酶的作用下通过循环扩增实时监测荧光信号的积累,实现荧光定量检测,所提出的方法在40 min内可检测到2.1 copies/μL的eaeA基因。该技术为E. coli O157∶H7的检测提供良好的研究基础和技术参考,填补了市场灵敏度高、便于储存的E. coli O157∶H7检测试剂盒的缺乏。

四环素双价适配体非酶免标记传感器

兰欣悦, 刘宁宁, 朱龙佼, 陈旭, 褚华硕, 李相阳, 段诺, 许文涛

2022, 38(3):  276-284.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1138

摘要 ( 348 )   HTML ( 10)   PDF (4479KB) ( 387 )  

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四环素（tetracycline,TC）作为广普性抗生素,在畜产养殖业中常因使用不当或滥用致使奶乳制品中出现抗生素残留,对人类健康造成严重威胁。传统检测方法如色谱,酶联免疫分析等,对仪器依赖性较强,且检测体系复杂、时间较长,不能很好地满足现场快速检测需求。因此,本研究设计了四环素双价适配体非酶标记传感器,以硫黄素T（ThT）荧光信号变化的形式响应检测结果,在10 nmol/L-1 μmol/L的四环素浓度范围内的对数值呈现良好的线性关系,R ²达0.99以上,检测限低至96 pmol/L,同时,还实现了在20 min内对牛奶样本中四环素的快速检测,且特异性良好。

其他

目录

2022, 38(3):  285-285. 

摘要 ( 104 )   PDF (356KB) ( 57 )  

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版权

2022, 38(3):  286-286. 

摘要 ( 80 )   PDF (153KB) ( 37 )  

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封面

2022, 38(3):  287-287. 

摘要 ( 97 )   PDF (76754KB) ( 55 )  

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