生物技术通报

拟南芥AtTERT对大肠杆菌非生物胁迫抗性的影响

杨佳慧, 孙玉萍, 陆雅宁, 刘欢, 卢存福, 陈玉珍

2022, 38(2): 1-9. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0498

摘要 ( 575 )

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端粒酶是真核生物中维持染色体末端DNA完整性的一类特殊逆转录酶,研究拟南芥AtTERT对大肠杆菌生长及非生物胁迫的影响,为深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基础。将拟南芥AtTERT转入大肠杆菌,成功构建pET32a-AtTERT原核表达载体,优化诱导条件,纯化并鉴定GST-AtTERT融合蛋白,运用Western blotting验证,同时采用点板法检测转AtTERT大肠杆菌的非生物胁迫抗性。结果表明,优化诱导条件为感受态细胞Transetta（DE3）诱导温度20℃、诱导剂（IPTG）浓度为0.5 mmol/L; 纯化的GST-AtTERT融合蛋白相对分子量大小为156 kD;Western blotting验证结果显示在诱导全菌、上清及沉淀中均出现并与预期分子量大小结果一致的蛋白条带。转AtTERT重组菌在NaCl（400和500 mmol/L）、甘露醇（400和600 mmol/L）和H₂O₂（0.4 mmol/L）的LB固体培养基上的存活率显著高于空载对照菌,而利用液氮反复冻融6次时,转AtTERT重组菌存活率显著低于空载对照菌。转AtTERT大肠杆菌NaCl盐胁迫、甘露醇渗透胁迫、过氧化氢氧化胁迫抗性增强,但低温抗性减弱,表明拟南芥AtTERT具有抗非生物胁迫的非端粒功能。

拟南芥RPP1A参与幼苗生长的蛋白质组学分析

李兵娟, 郑璐, 沈仁芳, 兰平

2022, 38(2): 10-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0542

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核糖体蛋白不仅参与蛋白质合成,而且参与植物生长发育的调控。利用拟南芥核糖体磷酸蛋白P1（ribosomal phosphoprotein P1,RPP1）家族基因RPP1A缺失突变体rpp1a研究RPP1A缺失对幼苗蛋白质表达水平的影响,揭示其参与调控幼苗生长的作用机制。表型分析发现,与野生型WT相比,RPP1A缺失导致拟南芥幼苗生物量、叶片总表面积和叶柄长度显著增加。基于label-free的蛋白质组学分析,与野生型相比,rpp1a-2突变体有280个蛋白质表达量具有显著差异,其中98个显著上调,182个显著下调。差异蛋白主要富集在细胞过程、代谢过程、刺激反应、细胞成分组织或生物发生和氧化还原过程等生物学过程,并在核糖体、光合作用、mRNA监视途径、RNA降解和苯丙素的生物合成代谢通路中显著富集。拟南芥rpp1a-2突变体通过抑制刺激反应和增强光合作用等过程促进植物生长。

马铃薯bHLH转录因子家族全基因组鉴定与表达分析

冯建英, 李立芹, 鲁黎明

2022, 38(2): 21-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1327

摘要 ( 688 )

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对马铃薯bHLH转录因子进行全基因组鉴定与表达模式分析,为其生物学功能研究提供借鉴。基于马铃薯基因组数据库和Pfam数据库,运用HMMER对马铃薯bHLH家族成员进行全基因组鉴定,剔除冗余序列后,利用ExPASy和MEME软件对候选序列进行基本理化性质及保守元件分析,并使用MEGA-X软件进行聚类分析;用MG2C和TBtools软件分别绘制染色体定位图和表达模式图。结果表明,从马铃薯基因组数据库中共检索出108个bHLH转录因子,其氨基酸数目为62-694个,分子量为7 527.78-75 939.94 Da,理论等电点为4.55-10.40。这些bHLH转录因子分布在马铃薯的12条染色体上,均具有典型的HLH结构域,可划分为16个亚族。基因表达模式分析表明,马铃薯bHLH家族成员具有组织表达特异性,多数响应盐、甘露醇、生长素、脱落酸、赤霉素及热等胁迫。马铃薯全基因组包括108个高度保守的bHLH基因家族成员,其表达具有组织特异性,并且响应非生物胁迫的诱导。

陆地棉GhSDP1及其启动子的克隆与表达分析

刘萌萌, 韩立军, 刘宝玲, 薛金爱, 李润植

2022, 38(2): 34-43. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1077

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三酰基甘油脂肪酶（SDP1）是催化三酰甘油降解的关键酶,在植物油脂代谢调控中起着重要作用。克隆棉花SDP1并研究其在3种胁迫下的表达分析,为解析棉花SDP1的生物学功能提供依据。以陆地棉品种冀丰1271为试材,克隆GhSDP1编码序列和上游启动子序列;利用PlantCARE分析GhSDP1启动子区顺式作用元件;qRT-PCR检测逆境胁迫下GhSDP1的表达谱;通过烟草瞬时表达pGhSDP1启动子+GUS载体检测启动子活性。结果表明,GhSDP1的编码序列为2 541 bp,其在盐、低温和干旱胁迫下呈差异表达模式。pGhSDP1除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个与光响应、激素响应及逆境应答等相关的顺式作用元件。棉花pGhSDP1启动子能驱动GUS蛋白高效表达,具有较强的启动子活性。研究揭示了棉花GhSDP1参与胁迫应答的新功能。

黄毛草莓F-box蛋白基因FnFBOX1及其启动子的克隆和表达分析

时雅倩, 申亚茹, 陈漫影, 何淑敏, 刘予涵, 何天楠, 陈清西, 文志丰

2022, 38(2): 44-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0295

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探索黄毛草莓FnFBOX1参与草莓胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染过程中的抗病反应和pFnFBOX1启动子的转录活性,为研究FnFBOX1抗炭疽病功能奠定基础。以黄毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schidl.）为研究对象,通过RT-PCR技术克隆FnFBOX1的cDNA序列。通过氨基酸序列比对、进化树分析、亚细胞定位、启动子克隆并构建瞬时表达载体、组织特异性表达分析,最后用荧光定量分析了抗病的黄毛草莓和感病的‘妙香 3’草莓在水杨酸（SA）和胶孢炭疽菌胁迫下FnFBOX1的表达水平变化。结果表明,FnFBOX1的ORF全长为1 227 bp,编码408个氨基酸。氨基酸序列比对和进化树分析发现FnFBOX1与森林草莓（Fragaria vesca）FvFBOX1同源性最高。亚细胞定位结果显示FnFBOX1定位于细胞核。克隆的FnFBOX1启动子长度为821 bp,构建pFnFBOX1的瞬时表达载体pFnFBOX1∷GUS。瞬时转化烟草后对其进行组织化学染色分析和GUS活性测定,结果表明,pFnFBOX1具有驱动下游基因转录的活性,且胶孢炭疽菌和SA可促进FnFBOX1启动子启动的GUS活性的提高。荧光定量PCR分析表明,FnFBOX1在黄毛草莓的不同组织中均有表达。抗病黄毛草莓和感病‘妙香 3’草莓均进行接种胶孢炭疽菌和喷施SA处理,结果显示,黄毛草莓接种胶孢炭疽菌12 h后FnFBOX1表达量达到最高,是0 h的6.3倍;SA处理24 h时,其表达量达到最高,是0 h的7.9倍。‘妙香 3’草莓也响应胶孢炭疽菌和SA处理,但FBOX1表达量比黄毛草莓低。

牡丹根腐病原菌拮抗细菌抑菌活性物质分析

杨瑞先, 刘萍, 王祖华, 阮宝硕, 汪智达

2022, 38(2): 57-66. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0337

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前期研究发现解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）md8和md9对牡丹根腐病原菌具有较好的抑制作用,但其抑菌物质的组成尚不清楚。本文首先明确了2个菌株3种脂肽类物质合成的基因片段,利用酸沉淀和葡聚糖凝胶层析法进行抑菌物质的分离纯化,牛津杯对峙法检测脂肽类粗提物和凝胶层析分离组分的抑菌活性;进一步利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测菌株在拮抗根腐病原菌过程中脂肽类物质合成基因相对表达量的变化,基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析抑菌物质的种类。结果表明,2个菌株的脂肽类粗提物和凝胶层析分离组分对根腐病原菌均具有良好的平板抑菌效果,RT-qPCR结果表明2个菌株合成伊枯草菌素（iturin）的基因ituD在对峙培养过程中相对表达量显著增加,芬荠素（fengycin）合成基因fenA也呈现上调表达。MALDI-TOF-MS分析表明2个菌株中具有抑菌作用的分离组分主要为伊枯草菌素类物质Iturin B和Bacillomycins D,结合实时荧光定量PCR结果,推测菌株md8和md9在拮抗根腐病原菌过程中发挥主要生防作用的物质为伊枯草菌素。

白及根腐病植株根际土壤微生物群落组成特征分析

赵林艳, 官会林, 向萍, 李泽诚, 柏雨龙, 宋洪川, 孙世中, 徐武美

2022, 38(2): 67-74. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0757

摘要 ( 517 )

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分析白及根腐病植株根际土壤微生物群落组成特征,为理解白及根腐病发病机理并针对性开展防治工作提供科学依据。利用Illumina HiSeq高通量测序技术,比较分析白及根腐病与健康植株根际土壤微生物群落结构特征,并对土壤理化性质与酶活性进行定量分析。白及根际土壤中优势真菌为子囊菌门（Ascomycota）和Mortierellomycota,优势细菌为变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。与健康植株相比,发病白及根际土壤Ascomycota相对丰度显著升高,而Mortierellomycota相对丰度显著降低;镰刀菌属（Fusarium）和白粉菌属（Erysiphe）等致病菌群相对丰度显著升高（P<0.05）。多元统计分析表明,健康与发病白及根际土壤细菌与真菌群落存在明显分化。此外,健康植株根际土壤脲酶、蛋白酶与蔗糖酶活性和有效钾含量较高,pH、有机质、铵态氮与硝态氮含量较低。白及根腐病的发生可能与土壤致病菌相对丰度升高、微生物群落结构变化、酶活性降低、养分失衡等因素有关。

低氮胁迫诱导木薯幼苗花青素积累及其基因表达

邹良平, 郭鑫, 起登凤, 翟敏, 李壮, 赵平娟, 彭明, 牛兴奎

2022, 38(2): 75-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0441

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为明确氮素浓度和形态与木薯花青素产生和积累的关系,基于氮素胁迫能够在拟南芥等植物中促进花青素产生的研究结果,以木薯品种Arg7为研究对象,研究木薯无菌幼苗在添加了（1）40 mmol/L NO₃^- + 20 mmol/L NH₄⁺,（2）40 mmol/L NO₃^-,（3）20 mmol/L NH₄⁺,（4）0.4 mmol/L NO₃^- + 0.2 mmol/L NH₄⁺,（5）0.4 mmol/L NO₃^-,（6）0.2 mmol/L NH₄⁺,（7）1 mmol/L（N）,（8）5 mmol/L（N）,（9）9 mmol/L（N）,（10）13 mmol/L（N）10种氮素浓度和形态的MS培养基中生长40 d的农艺性状,以及对花青素合成相关结构基因的诱导和花青素积累的差异。结果表明,木薯品种Arg7无菌幼苗在添加有40 mmol/L NO₃^- + 20 mmol/L NH₄⁺,40 mmol/L NO₃^-和20 mmol/L NH₄⁺的MS缺氮培养基中生长至40 d,没有观察到花青素产生;与40 mmol/L NO₃^- + 20 mmol/L NH₄⁺处理条件相比,在40 mmol/L NO₃^-条件下的株高和初生根根长没有显著差异,但初生根根数显著减少,而在20 mmol/L NH₄⁺条件下其株高、初生根根长和初生根根数都受到极显著抑制;木薯品种Arg7无菌苗在含有0.4 mmol/L NO₃^- + 0.2 mmol/L NH₄⁺,0.4 mmol/L NO₃^-和0.2 mmol/L NH₄⁺的MS缺氮培养基中生长至40 d,3种处理条件下的木薯茎秆和叶柄中花青素积累明显,花青素合成相关结构基因被诱导表达;与40 mmol/L NO₃^- + 20 mmol/L NH₄⁺条件下相比,在0.4 mmol/L NO₃^- + 0.2 mmol/L NH₄⁺,0.4 mmol/L NO₃^-和0.2 mmol/LNH₄⁺条件下的株高、初生根根长和根数极显著降低,而花青素含量极显著增加,且花青素含量随着氮素浓度增加呈负相关关系（R²=0.96）。由此表明,木薯品种Arg7无菌幼苗植株中花青素的诱导表达只与氮素浓度有关,而与氮素形态无关。

紫鸭跖草根组织应答铜胁迫的转录组分析

彭国颖, 胡亮, 黄超, 杨坤, 万玮, 黄长干

2022, 38(2): 83-94. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0664

摘要 ( 355 )

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紫鸭跖草是一种高耐铜的超积累植物,本研究首次应用RNA-Seq技术对其转录组进行分析。通过全长转录组分析组装了紫鸭跖草耐铜相关候选基因,通过转录组分析,共获得82 471条N50长度为2 299 bp的高质量unigene,为紫鸭跖草的进一步研究提供了丰富的数据。对照组（CK）、300 µmol/L胁迫组（CT1）和1 000 µmol/L胁迫组（CT2）的测序数据已保存在NCBI的SRA数据库中,登录号为SAMN11265427。CT1相比于CK,共有5 028条unigene在根组织中有显著性差异表达,约占全部unigene的6.10%,其中富集上调和下调的基因分别为3 138和1 890条;CT2相比于CT1,根中共有6 813个unigene富集差异表达,占所有unigene的8.26％。其中富集上调和下调的基因分别为2 555和4 258。随机选取10个基因进行qRT-PCR荧光定量分析,结果与Illumina测序数据一致,验证了基因数据差异表达的有效性。上述实验从分子水平上为研究铜胁迫下铜耐受的分子机制提供了理论依据。

重楼中一株产纤维素酶内生真菌的分离及鉴定

张功友, 王一涵, 郭敏, 张婷婷, 王兵, 刘红美

2022, 38(2): 95-104. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0266

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从重楼根茎中分离、鉴定具有产纤维素酶活性的内生真菌。采用表面消毒法从重楼块茎中分离内生真菌;用纤维素酶活性CMC平板检测分离菌株的产纤维素酶活性;对高产菌株进行形态学观察和分子生物学测序鉴定;探究影响纤维素酶活力的因素;利用平板法检测该株菌产其他胞外水解酶的活性。从3个来源的重楼中分离出41株内生真菌,通过平板检测发现AS-5、AS-7、AS-9和AS-18菌株能产生纤维素酶,其中AS-9菌株活性最强;通过形态学观察和ITS、LSU序列分析将AS-9菌株鉴定为Setophoma terrestris;该菌在pH值为7.0和温度为28℃时表现出最大纤维素酶活性,紫外线照射对产纤维素酶活性无明显作用;检测发现AS-9菌株同时具有产酪蛋白酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶和脲酶活性。首次在重楼中发现内生真菌Setophoma terrestris,且具有较好的产纤维素酶能力,值得深入研究。

一株产木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌对雪茄烟叶成分及发酵产物的影响

李志豪, 张鸽, 貊志杰, 邓帅军, 李佳轶, 张海波, 刘晓晖, 刘好宝

2022, 38(2): 105-112. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0349

摘要 ( 395 )

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雪茄烟叶中的半纤维素在叶脉及叶片韧性等特性中发挥重要作用,烟叶叶脉较粗,半纤维素含量过高,导致雪茄烟叶韧性较差,可用性变差。本实验室前期筛选到一株产木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌,该菌株对烟碱有较好的耐受性,利用液态发酵方法研究菌株以雪茄烟叶为营养源产木聚糖酶的最佳发酵条件,并对最佳发酵条件下菌株降解烟叶中半纤维素的效果进行测定,最后分析比较了菌株对雪茄烟叶香气物质成分及含量的影响。结果表明,菌株在含有不高于1.0 g/L烟碱的培养基中生长受抑制较小,菌株对烟碱有良好的耐受性;当培养基中初始 pH 6.7,接种量为5%,雪茄烟叶底物浓度为20 g/L,发酵24 h,菌株产木聚糖酶活性最高,可达（4.04±0.18）U/mL;在最佳发酵条件下,雪茄烟叶中半纤维素含量为3.38%,降低了6.63%,纤维素含量为10.54%,降低了8.19%,利用菌株发酵同时降低了雪茄烟叶中纤维素和半纤维素含量;通过对香气物质影响的分析比较,发现经菌株发酵后的雪茄烟叶能够提升叶绿醇（2.85%）、油酸（0.62%）、正二十六烷（1.75%）和正三十一烷（14.47%）等物质的含量。蜡样芽孢杆菌 B. cereus 对雪茄烟叶中半纤维素及纤维素降解具有一定作用,后期可应用于雪茄外包皮烟叶的固态发酵,进一步改善雪茄外包皮烟叶的物理特性,为该菌株的开发利用奠定基础。

烟嘧磺隆降解菌Chryseobacterium sp. LAM-M5的分离、鉴定及其降解机理研究

马青云, 江旭, 李情情, 宋金龙, 周义清, 阮志勇

2022, 38(2): 113-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0243

摘要 ( 478 )

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为获得更丰富的烟嘧磺隆降解菌资源,以合肥某烟嘧磺隆生产厂活性污泥为研究对象,从中分离并筛选得到一株能以葡萄糖为唯一碳源、烟嘧磺隆为唯一氮源生长的菌株,根据其表型特征、16S rRNA序列相似性、DNA-DNA杂交值（DDH）和平均核苷酸一致性（ANI）的分析结果,将其鉴定为Chryseobacterium lacus LAM-M5。该菌株可在7 d内将初始浓度为50 mg/L的烟嘧磺隆降解92.39%。利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对菌株LAM-M5与烟嘧磺隆混合培养后的代谢产物进行检测与鉴定,共有5种主要物质被检测到,根据烟嘧磺隆的化学结构式和中间代谢产物特征,初步推测出菌株Chryseobacterium sp. LAM-M5降解烟嘧磺隆的可能降解途径。利用高效液相色谱（HPLC）对接菌后降解体系内代谢产生的酸类物质进行分离与鉴定,结果表明产物主要为L-苹果酸。推测菌株LAM-M5受高浓度烟嘧磺隆胁迫,利用葡萄糖产生L-苹果酸,通过降低环境 pH使烟嘧磺隆发生水解,从而解除其胁迫。通过对菌株全基因组信息进行分析,预测了7种可能与烟嘧磺隆降解相关的基因。结果表明,菌株LAM-M5 具有较强的烟嘧磺隆降解能力,在烟嘧磺隆污染环境的生物修复上具有较好的应用潜力。

来自Yeosuana marina sp. JLT21内切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学表征

常晴, 束月蓉, 王文韬, 蒋昊, 延泉德, 钱政, 高雪纯, 吴金鸿, 张勇

2022, 38(2): 123-131. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0539

摘要 ( 402 )

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褐藻寡糖有着丰富的生物学功能,酶法制备功能性褐藻寡糖具有重要实践应用价值。为发掘高活性及稳定性的褐藻寡糖制备酶,对浅海热液嗜热菌Yeosuana marina sp. JLT21中的海藻酸裂解酶YMA-1的基因在大肠杆菌中进行表达、纯化及酶活鉴定。结果发现YMA-1由306个氨基酸残基构成,是多糖裂解酶家族7（PL7）新成员;重组YMA-1酶的最适催化条件是55℃,pH 9.0,比活力1.3×10⁴U/mg,Cu²⁺ 可有效促进酶活;在37℃,pH 9.0 条件下,该酶对海藻酸钠、聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的比活力分别达到（5 201.21±86.46）U/mg、（6 399.73±253.12）U/mg和（3 751.68±116.25）U/mg,酶解海藻酸钠终产物多为不饱和三糖和四糖,表现出内切双功能型海藻酸裂解酶活性。YMA-1酶作为PL7家族中较宽底物谱、高活性及稳定性的内切海藻酸裂解酶,在高效绿色生产功能性褐藻寡糖上有着潜在应用价值。

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

关怡, 李新, 王定一, 杜茜, 张龙斌, 叶秀云

2022, 38(2): 132-140. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0210

摘要 ( 340 )

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为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因（DEGs）,其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力（oxidoreductase activity）和单加氧酶活力（monooxygenase activity）功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。

启动子PpetE与Pcpc560对集胞藻PCC 6803生物合成乙醇的影响

叶鹏林, KwasiKyere-Yeboah, 高恶斌

2022, 38(2): 141-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0241

摘要 ( 443 )

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为了增加工程集胞藻PCC 6803的乙醇合成产量,通过选用强启动子Pcpc560 驱动并提高外源乙醇合成基因（pdc,yqhD）的表达,从而促进乙醇的生产。具体方法利用同源双交换引入来源于运动型发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因（pdc）与来源于大肠杆菌的NADPH依赖型醛还原酶基因（yqhD）并选用不同的启动子来驱动其表达。通过逆转录定量PCR分析,比较在不同启动子驱动的情况下,外源乙醇合成基因（pdc,yqhD）的表达情况并检测相应突变株的乙醇产量。结果显示相较于中等启动子,铜离子诱导启动子PpetE,来源于集胞藻PCC 6803的光强启动子Pcpc560显著促进了外源乙醇合成基因（pdc,yqhD）的表达,并增加了工程菌株乙醇合成的产量。超强启动子Pcpc560搭配pdc,yqhD的组合表达,显著提高了工程菌株的乙醇合成产量。

铁皮石斛多糖对高脂饮食小鼠肠黏膜结构及菌群的影响

谢果珍, 唐圆, 宁晓妹, 邱集慧, 谭周进

2022, 38(2): 150-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0390

摘要 ( 452 )

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为考察铁皮石斛多糖对高脂饮食小鼠肠黏膜屏障的影响,采用水提醇沉法提取铁皮石斛多糖,联合高脂饲料给予小鼠8周后观察肠黏膜结构及肠黏膜菌群的变化。结果显示高脂饮食显著破坏了肠黏膜结构,表现为肠黏膜萎缩,上皮细胞脱落并伴有炎性渗出,Corynebacterium_1及Staphylococcus等与感染及炎症相关的菌属大量增殖。铁皮石斛多糖对肠黏膜结构有较好的保护作用,并可减少Corynebacterium_1的丰度,同时提高肠黏膜共生菌Candidatus_Arthromitus的丰度,促进了 Muribaculaceae、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group等碳水化合物代谢、短链脂肪酸产生相关菌的增殖。研究表明铁皮石斛多糖对肠黏膜屏障的保护作用或与其维持肠黏膜结构完整,调节肠黏膜菌群组成及促进碳水化合物代谢,生成短链脂肪酸有关。

纳豆中抗氧化肽的分离纯化与活性研究

张丰文, 周丽亚, 董超, 史延茂

2022, 38(2): 158-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0379

摘要 ( 482 )

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从发酵的纳豆中提取具有抗氧化活性的多肽,通过分子筛层析和反相高效液相色谱对纳豆上清液进行分离纯化,并采用电喷雾串联质谱进行结构鉴定。结果表明：纳豆发酵后的蛋白（多肽）混合物经Sephadex G-50 凝胶色谱进行分离纯化后得到3个组分（F1、F2和F3）,其中组分F3的抗氧化活性最强,总还原力达到（8.4±0.6）mmol/g,显著高于其他组分;组分F3经半制备RP-HPLC液相色谱分离纯化得到4个组分（G1、G2、G3和G4）,选取含量最高的G1和G3进行活性测定,测得G1的DPPH 自由基清除率达到32.67%。通过 ESI-MS/MS对G1组分抗氧化肽进行一级序列鉴定,得到含量最高和活性最强的10种抗氧化肽序列,并用化学合成的方法对其活性进行验证,得到肽段SFEWVLEH的活性最强,其DPPH清除率为46.66%±0.96%。

不同年龄大鼠尿液代谢组学研究

杨玉萍, 张霞, 王翀翀, 王晓艳

2022, 38(2): 166-172. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0331

摘要 ( 445 )

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旨在探究健康大鼠的尿液代谢物在生长、发育和衰老过程中的年龄相关性变化。采集大鼠出生后3周、5周、7周、9周、12周、56周和111周共7个年龄点的尿液样本,利用GC/TOF-MS平台进行代谢组学检测。结果显示,所有尿液样本在主成分分析与偏最小二乘法判别分析中出现组内聚类和组间分离。氨基酸类、有机酸类和碳水化合物类代谢物是大鼠尿液样本中的主要代谢物类型。尿液代谢物如4-羟基脯氨酸、L-赖氨酸和尿酸等随年龄增加逐渐下降,D-核糖、乌头酸和富马酸等在老年阶段水平升高,而烟酸和5-羟基吲哚等在老年阶段水平下降。以上结果揭示了年龄影响大鼠尿液代谢,多种尿液代谢物在生长、发育和衰老过程中出现年龄相关性变化。

基于Methylovorus sp. J1-1基因组尺度代谢网络优化吡咯喹啉醌合成

寇航, 王艳梅, 李彤, 薄明井, 张惟材, 熊向华, 黎明

2022, 38(2): 173-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0345

摘要 ( 372 )

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通过构建Methylovorus sp. J1-1基因组尺度代谢网络模型（genome scale of metabolic network model,GSMM）,发掘能够提升吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone,PQQ）产量的发酵策略和相关靶基因。基于其注释的基因组和生化信息,构建J1-1的GSMM。再通过COBRApy预测可能使PQQ产量提高的氨基酸和潜在的靶基因并进行验证。构建了Methylovorus sp. J1-1的GSMM模型iKH584,共有584个基因,779个生化反应,121个交换反应与765个代谢产物,且可以用于后续模拟。根据iKH584模拟,外源添加谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸、过表达glyA与hps1以及敲除hps2基因,均具有促进PQQ合成效果。结果表明：添加谷氨酸与脯氨酸时,PQQ的产量分别提高了10.4%与22.9%;过表达基因glyA与hps1,PQQ产量分别提高20.6%与14.6%;敲除基因hps2,PQQ产量最高可达140.84 mg/L,提高了8.0%,这与模拟结果基本一致,表明构建的模型基本正确。最后,在5 L发酵罐进行J1-1△hps2的分批补料发酵,PQQ的产量为812.64 mg/L,比亲本菌株提高了11.1%。建立的模型可以用来指导J1-1的发酵和菌株改造,提高PQQ产量。

植物磷稳态的调控机制

刘潮, 褚洪龙, 吴丽芳, 唐利洲, 韩利红

2022, 38(2): 184-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0472

摘要 ( 776 )

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磷是植物必需的重要营养元素之一,是生物大分子的重要组成部分,在植物生命过程中发挥着不可或缺的作用。维持体内磷稳态对于植物的生长发育和环境应答至关重要。多种信号分子参与调控植物对磷的吸收和转运。植物维持磷稳态主要包括土壤磷的活化、磷的吸收、转运、存储和再利用等过程,涉及磷胁迫响应、转录因子调节、miRNA调节、菌根共生、细胞器间转移等磷调节机制。未来的磷营养机制研究需要跨学科知识的融合,由模式植物研究转向栽培作物。全面总结了植物细胞磷吸收和转运的核心分子及其作用机制的研究进展,旨在为作物品种改良和遗传育种提供重要借鉴。

赤霉素代谢调控与绿色革命

李毅丹, 单晓辉

2022, 38(2): 195-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0389

摘要 ( 985 )

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赤霉素作为重要的植物激素,参与了植物诸多发育过程的调控。一些涉及赤霉素生物合成和信号传导途径的重要调控基因对作物的株型、产量和品质能够产生积极的影响,已在农业生产中得到广泛应用。其中,Rht-1和sd-1等位基因由于分别赋予了小麦和水稻半矮化的特性,从而促成了20世纪后半叶的“绿色革命”。本文回顾了与“绿色革命”相关的赤霉素代谢调控在影响作物株高、产量、养分利用等方面的研究成果,并对未来如何合理开发和利用赤霉素调控基因,培育出更多的“绿色革命”作物品种进行了展望。

解淀粉芽孢杆菌分子遗传操作及其应用研究进展

邱益彬, 马艳琴, 沙媛媛, 朱逸凡, 苏二正, 雷鹏, 李莎, 徐虹

2022, 38(2): 205-217. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0447

摘要 ( 538 )

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解淀粉芽孢杆菌是FDA认定的安全级（generally recognized as safe,GRAS）菌株,在工业酶制剂、高分子聚合物、大宗化学品、绿色生物农药等方面的生产具有突出的优势。近年来,随着解淀粉芽孢杆菌的分子遗传操作技术越来越成熟,对利用该菌开发成微生物发酵平台化菌株用于合成生物学制造领域提出了更迫切的需求。文中围绕解淀粉芽孢杆菌的遗传操作工具、代谢改造应用和未来发展前景等方面进行了详细综述,为进一步推动解淀粉芽孢杆菌合成生物学技术的创新与发展提供借鉴和参考。

抗病毒核苷酸类似物磷酸化修饰研究进展

梁星星, 王佳, 许文涛

2022, 38(2): 218-226. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0565

摘要 ( 477 )

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核苷（酸）类似物是一类抗病毒前药,其进入人体细胞后经过逐步磷酸化生成核苷三磷酸类似物发挥抗代谢药作用,主要通过抑制病毒复制和促进侵染细胞凋亡,达到疾病治疗效果。其中,核苷类似物在细胞内经激酶活化的代谢转化过程通常是不充分的,导致最后生成的核苷三磷酸类似物浓度较低,降低了作用效果。因此,通过直接制备核苷酸类似物作为抗病毒前药,在磷酸基上修饰亲脂的、可裂解的基团,使其稳定性提高,细胞吸收摄取能力增强,可避开细胞内的磷酸化限速步骤,从而有效提高最终的活性核苷三磷酸浓度,发挥更好的抗病毒作用。总结了核苷酸类似物的发展过程,列举分析了不同类型核苷酸类似物的合成和修饰手段,以期为进一步发展高效安全的抗病毒核苷酸类似物提供良好借鉴。

生物脱氮中工程纳米颗粒的毒害作用及减毒措施的研究进展

张漫漫, 何腾霞, 丁晨雨, 陈梦苹, 吴启凤

2022, 38(2): 227-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0470

摘要 ( 346 )

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氮化合物在生命代谢过程中扮演着重要的角色,但过多的无机氮会导致水体恶化进而影响人类健康,生物脱氮技术可高效去除环境中的无机氮且不引起二次污染。随着工程纳米颗粒在生活中的广泛应用,导致其大量释放到土壤及水体中,极大地阻碍了废水处理中的生物脱氮过程,因此,微生物脱氮过程中工程纳米颗粒的毒害作用及减毒措施成了近年来的研究热点。阐述了工程纳米颗粒进入水环境的方式,系统分析了工程纳米颗粒对废水处理系统和生物脱氮过程的影响,详细说明了工程纳米颗粒对脱氮微生物的毒害作用、脱氮微生物的抵御机制及减毒措施,并对未来的研究趋势进行了展望。旨为提高工程纳米颗粒存在条件下的脱氮效率具有重要的理论指导意义,同时,可促进工程纳米颗粒对耐冷异养硝化和好氧反硝化菌的毒害及应激机制研究。

超氧化物歧化酶翻译后修饰的研究进展

贾海红, 李冰清

2022, 38(2): 237-244. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0611

摘要 ( 607 )

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超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶,它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧（O₂）和过氧化氢（H₂O₂）,在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用,且与很多疾病的发生、发展密不可分。对SOD的活性调节一直是研究热点,大多数研究都集中在转录水平（基因表达）和翻译水平（酶蛋白合成）两个方面。随着研究的深入,发现蛋白质翻译后修饰（PTM）对SOD的酶活性有重要影响。近年来,研究蛋白质翻译后修饰对SOD的酶活性的影响越来越受到重视。总结了硝基化、磷酸化、S-谷胱甘肽化、糖基化、乙酰化、次磺酸化、亚磺酸化、SUMO化等几种SOD翻译后的修饰方式,讨论了修饰后对SOD酶活性的影响和生理意义,并对SOD翻译后修饰的发展及面临的挑战进行了展望,为相关疾病的研究、治疗及靶向药物的研制提供了理论基础。

核糖核酸5'端NAD⁺帽子修饰研究进展

董海娇, 杨晓玉, 莫蓓莘, 陈雪梅, 崔洁

2022, 38(2): 245-251. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0975

摘要 ( 668 )

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m7G帽子具有保护RNA不被降解以及招募相关蛋白参与内含子剪切、poly（A）加尾、出核和翻译等功能。一直以来,它被认为是真核生物mRNA所特有的修饰类型。然而近年来,在包括原核生物在内的多个物种中均检测到一种新的RNA 5'端修饰,即核酸代谢物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD⁺）帽子。目前NAD⁺修饰RNA（NAD-RNA）的生物学功能研究仍处于起始阶段。本文概述了NAD-RNA的发现及其检测和鉴定技术的发展;探讨了NAD⁺帽子对RNA的调控功能,以及NAD-RNA脱帽和加帽的影响因素;并进一步推测NAD-RNA在生物的生长、发育和环境响应中发挥的潜在功能。最后,展望了未来NAD-RNA的研究方向和主题。

透明质酸的生物合成及其代谢工程的研究进展

马艳琴, 邱益彬, 李莎, 徐虹

2022, 38(2): 252-262. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0443

摘要 ( 764 )

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透明质酸（hyaluronic acid,HA）是广泛存在于生物体内的功能性糖胺高分子聚合物,在日化、医疗和食品领域应用前景广阔。随着基因工程与代谢工程等合成生物学技术的发展,人们对HA的生物合成过程和机理解析越发深入的同时,也伴随一些新的挑战来临。该综述从分子生物学角度总结了HA的关键合成酶基因及合成途径,对不同来源的HA合成酶进行了氨基酸序列比对分析,并详细描述了HA在常用微生物宿主中生产的安全性、底物不平衡性、发酵低溶氧性等瓶颈问题及其相应的合成生物学策略开发,从而归纳出了目前微生物中高产HA的有效策略,为进一步推动HA的绿色生物制造提供了重要的科学依据和理论支撑。

茶树原位转化方法的建立

周承哲, 常笑君, 朱晨, 程春振, 陈裕坤, 赖钟雄, 林玉玲, 郭玉琼

2022, 38(2): 263-268. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0635

摘要 ( 635 )

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解决茶树缺乏高效、稳定的遗传转化体系问题,建立了一种基于根癌农杆菌介导的茶树原位转化转基因方法,为茶树基因功能研究和种质创新奠定坚实的基础。以茶树品种‘铁观音’、‘白叶1号’和‘龙井43’的实生幼苗为受体材料,进行去顶芽和腋芽处理。利用根癌农杆菌菌液侵染实生苗伤口,通过抗性筛选获得再生芽,经分子生物学鉴定后,采用短穗扦插法获得茶树转基因植株。结果表明,再生芽中GUS（β-glucuronidase）和HYG（hygromycin）标记基因经多次PCR检测均为阳性,经测序验证PCR产物序列与标记基因序列一致。‘铁观音’、‘白叶1号’和‘龙井43’的转化率分别为8.14%、2.99%和2.53%。建立了不依赖茶树组织培养的原位转化转基因体系,具有操作简便、转化率高、成本低、试验周期短的特点。

重组酶聚合酶扩增技术在植物病毒检测中的应用

罗雪琮, 安梦楠, 吴元华, 夏子豪

2022, 38(2): 269-280. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0453

摘要 ( 723 )

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随着分子生物学技术的发展,多种核酸等温扩增技术逐渐被开发出来。其中,重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）作为一种快速、灵敏的检测技术具有很大的优势。目前,RPA已应用于转基因生物、各类病原物及食品安全检测等多个领域,并作为新兴技术在植物病毒检测领域中快速发展。RPA技术只需一对引物,在恒温条件下（37-42℃）只需30 min左右即可完成反应,具有较高的灵敏度与特异性。因此,该技术正迅速成为一种能够用于条件有限的实验室或现场植物病毒检测的手段。本文介绍了RPA技术的检测原理、引物设计和应用方式,综述了其在植物病毒检测中的最新研究进展及存在的问题,为RPA技术在植物病毒检测中的应用提供参考。

利用小RNA深度测序技术检测灰飞虱病毒种类

朴君, 张璐婕, 朴敬爱, 周益军, 李硕

2022, 38(2): 281-288. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0461

摘要 ( 430 )

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灰飞虱是一种重要农业害虫,作为病毒介体,可以传播多种植物病毒引起水稻、小麦和玉米等粮食作物病毒病害。目前对于灰飞虱体内昆虫病毒种类尚缺乏系统认识,难以开展利用昆虫病毒防治灰飞虱相关研究工作。为挖掘灰飞虱体内昆虫病毒资源,本文通过小RNA深度测序技术对灰飞虱所携带的病毒种类进行分析鉴定。结果显示,测序数据比对得到13种病毒,涉及8个病毒科和2种未分类病毒。除占据优势的水稻条纹病毒外,其余均为专性寄生的昆虫病毒,包括5种正链RNA病毒、2种单链DNA病毒和5种双链DNA病毒。在这些病毒中,发现了一种与果蝇A病毒较相似的新病毒,克隆出其依赖RNA的RNA聚合酶（RdRP）基因1-1 932位核酸序列,经Blast比对和系统进化分析,在氨基酸序列中发现RdRP掌型亚结构域保守区呈现复制酶置换四体病毒科（Permutotetraviridae）病毒所具有的“C-A-B”排列样式,确定该病毒是一种新的类复制酶置换四体病毒,暂命名为Laodelphax striatellus permutotetra-like virus（LsPLV）。这是首次在半翅目昆虫中发现类复制酶置换四体病毒。本研究表明灰飞虱体内昆虫病毒种类较为丰富,为今后利用昆虫病毒生物防治灰飞虱奠定了基础。

植物合成生物学领域发展态势的文献计量分析

郭晓真, 张学福

2022, 38(2): 289-296. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1600s

摘要 ( 420 )

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合成生物学作为一种颠覆性技术可应用于农业领域的创新发展,解决当前农业学科中的瓶颈问题。利用文献计量学方法从领域发表论文的时序数量分布、主题分布等探测当前合成生物学的基本态势。基于领域的主题分布可知,其中植物合成生物学这一主题是稳定存在的且主题规模处于稳定增长趋势。聚焦植物合成生物学这一主题方向,在构建引文网络的基础上利用主路径分析方法从知识流动角度探测植物合成生物学领域重要知识节点,内容涵盖介子油苷生物合成途径,重要催化酶功能解析、转录因子的调控作用,组学方法的应用,利用微生物酵母进行生物物质合成,这些内容表征了合成生物的核心理论技术。

2022, 38(2): 297-297.

摘要 ( 136 )

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