生物技术通报

小肽调控植物分生组织发育的机制及其在作物改良中的研究进展

刘文浩, 吴刘记, 徐芳

2024, 40(7): 1-18. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0193

摘要 ( 287 )

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在高等植物的生长发育过程中，根尖分生组织和茎尖分生组织不断分裂分化产生根系、茎、叶和花等器官，分别形成植物的地上和地下部分。小肽是胞间通讯的关键信号分子之一，参与了植物生长发育、抗病抗逆等诸多生命活动，其中包括植物根尖和茎尖分生组织的干细胞活性调控，进而影响了植物器官的生成和发育。近年来，越来越多的研究揭示了小肽分子在分生组织维持和发育中的重要性，及其在多种作物农艺性状调控中的关键作用。本文综述了小肽及其受体在拟南芥和作物中维持分生组织稳态的分子机制，探讨了小肽对作物产量性状的影响及在作物改良中的应用策略，并对小肽领域的研究方向进行了分析和展望。

生长素信号途径参与调控拟南芥雌配子体发育研究进展

杨嘉泓, 李婧怡, 吴佳昊, 黄幼梅, 刘艳芬, 秦源, 蔡汉阳

2024, 40(7): 19-27. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0109

摘要 ( 206 )

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雌配子体发育是开花植物有性生殖的重要前提，包括大孢子发生和雌配子体发生两个关键事件，该过程决定植物能否正常受精作用并完成世代繁衍。生长素是植物中广泛存在的一类植物激素，生长素在胚珠中的极性分布保证了胚珠的正常发育，但由于生长素信号途径十分复杂，且雌性生殖细胞位于组织内部，生长素信号途径在雌性生殖系建成的调控网络和分子机制仍不明晰。本文综述了生长素的合成、动态平衡和信号转导以及生长素调控大孢子发生和雌配子体发生相关研究，旨在对生长素激素信号途径调控雌性生殖系建成提供参考。

植物花青素修饰相关UDP-糖基转移酶研究进展

王青, 倪尔冬, 王秋霜, 秦丹丹, 方开星, 李红建, 姜晓辉, 李波, 潘晨东, 吴华玲

2024, 40(7): 28-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1065

摘要 ( 201 )

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糖基化在植物天然产物的结构多样性和稳定性中起着重要的作用。植物体内游离的花青素不稳定，通常会在尿苷二磷酸依赖的糖基转移酶（UGTs）的催化下形成稳定的花青苷。近年来，关于花青素糖基化修饰的报道越来越多，在不同植物中均发现了参与花青素糖基化修饰的各种酶。本文主要综述了植物中花青素修饰相关UGT的结构特点、代谢途径作用节点、生化作用过程、分子鉴定与转录调控等方面的研究进展，以期为植物花青素糖基化修饰及其调控过程研究提供参考。

植物赤霉素氧化酶及其功能研究进展

吴丁洁, 陈盈盈, 徐静, 刘源, 张航, 李瑞丽

2024, 40(7): 43-54. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1177

摘要 ( 391 )

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赤霉素（gibberellin, GA）是一种重要的植物激素，调节植物的发育及其对环境信号的反应。GA生物合成的最后部分离不开赤霉素氧化酶（gibberellin oxidase，GAox）的催化。赤霉素氧化酶是赤霉素生物合成和分解代谢过程的关键酶，在植物体内的赤霉素生物合成和分解代谢途径中起到复杂的调节作用。GA20ox（gibberellin 20 oxidase）、GA3ox（gibberellin 3 oxidase）和GA2ox（gibberellin 2 oxidase）均属于赤霉素氧化酶基因家族，GA20ox和GA3ox是赤霉素生物合成过程中的限速酶，而GA2ox是赤霉素分解代谢的关键酶，三者共同参与GA生物合成途径的调节，从而保障植物在生长发育以及与环境相互作用过程中对GA的需求。赤霉素氧化酶参与调控植物生长发育的多个阶段，受到外界环境和内源因素的精密调控，目前已经在拟南芥、水稻、杨树等物种中克隆表达，其在不同物种之间的功能存在差异。本文主要围绕GA20ox、GA3ox和GA2ox三种酶进行介绍，对植物赤霉素氧化酶的特性、时空表达进行了阐述，并重点总结了赤霉素氧化酶的功能及其研究进展，以期为今后系统开展赤霉素氧化酶基因功能研究提供理论依据。

植物DNA双链断裂修复机制及其在重离子诱变和基因编辑中的作用

隆静, 陈婧敏, 刘霄, 张一凡, 周利斌, 杜艳

2024, 40(7): 55-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0033

摘要 ( 710 )

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在自然界中，植物会遭受各种环境或内源因素导致的DNA损伤，其中DNA双链断裂（double strand breaks, DSBs）的影响最为严重，如果修复不当，将导致基因组不稳定、基因突变甚至细胞死亡。一方面，植物进化出了强大且有序的损伤修复机制，以确保其存活及正常繁衍；另一方面，基于修复过程的容错性及致突变性，T-DNA插入、基因编辑、物理诱变等技术广泛应用于动植物品种改良。相较于哺乳动物，植物DSBs修复通路及其分子机制报道较为有限。本文综述了植物对DSBs损伤的响应、主要修复途径及关键因子，介绍了通路机制尚未完全解析的替代末端连接（alternative end joining, Alt-EJ）的最新研究进展；此外，探讨了重离子束引起的植物DSBs修复特征和多途径选择，以及基于不同DSBs修复途径的基因编辑技术的研究进展，旨在为深入了解植物DSBs损伤响应及修复的分子机制和研发高效生物育种技术提供参考。

基因编辑技术在棉花种质创新和遗传改良中的应用

侯文婷, 孙琳, 张艳军, 董合忠

2024, 40(7): 68-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1054

摘要 ( 2147 )

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棉花是全球重要的经济作物和纺织工业原料，选育优良新品种是提高棉花产量、品质和植棉效益的主要途径。然而，传统育种方法在改良作物遗传特性方面存在很大的局限性，而基因编辑技术为加快棉花种质创新和遗传改良提供了契机。基因编辑技术是一种利用人工设计的核苷酸酶，对生物体特定DNA序列的基因组片段进行删除、修改、插入或替换单个或多个核苷酸，从而实现对目标基因精确编辑的技术方法。本文首先综述了ZFNs、TALENs和CRISPR三种主要基因编辑系统的原理，以更好地理解如何利用基因编辑技术改良棉花的生长发育、抗逆性等性状；其次，重点评述了当前备受关注的CRISPR基因编辑系统在改良棉花抗逆性、纤维与种子品质性状等方面的应用；最后分析了基因编辑技术在应用过程中存在的不足和局限，并指出未来应进一步优化开发有知识产权的基因编辑系统，提高其精确性、安全性，促进其在棉花种质创新和遗传改良中的应用。

动物细胞永生化研究进展

张震宇, 靳莉武, 王婧尊, 田玲, 乔自林, 杨迪, 阿依木古丽·阿不都热依木

2024, 40(7): 78-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0020

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细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制，延长细胞寿命，实现细胞无限复制增殖，是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等；然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难，肿瘤风险以及动物福利伦理等原因，还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源，还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述，为未来的生物医学研究和应用提供参考。

基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台的机制研究及应用

陈墨岩, 祝诚

2024, 40(7): 90-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0118

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CRISPR/Cas12a系统能够由可编程的RNA引导，准确识别特异的单链DNA或含有PAM序列的双链DNA，而后在目标底物进行切割的同时完成对非特异性单链DNA的迅速切割，该特性使其在生物传感应用中显示出巨大前景。近年来，CRISPR/Cas12a系统被广泛应用于生物标志物的辅助检测，其生物标志物传感平台已在可视化细胞途径、体内活体诊断等生物分子传感器的构建方面得到应用。本文基于CRISPR/Cas12a生物传感平台的构建原理，对不同应用情景下CRISPR/Cas12a系统的变体进行了总结，并对基于该系统的体外、体内传感平台的应用进行了重点介绍和归纳，进一步讨论了不同传感平台的特点。最后对目前应用的优点和局限性做出总结和展望，以期为该领域的研究与应用提供一定参考。

利用代谢工程在酿酒酵母中高效合成2-萘乙醇

何玙冰, 付振浩, 李仁瀚, 刘秀霞, 刘春立, 杨艳坤, 李业, 白仲虎

2024, 40(7): 99-107. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0225

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【目的】 为实现生物合成重要化合物2-萘乙醇，探索利于2-萘乙醇合成的基因组合。【方法】 向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加2-萘丙氨酸，运用高效液相色谱法进行产物检测；绘制BY4741的生长曲线和产量曲线，添加不同浓度2-萘丙氨酸到BY4741发酵液中并检测BY4741生长和生产情况；对BY4741进行代谢工程改造，构建过表达Ehrlich途径6个基因的质粒并转化进BY4741中；发酵6株改造菌株，检测产物产量。【结果】 发酵液中检测到了推测产物2-萘乙醇，代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741菌株产量均有所提升，其中过表达ARO9和ARO10基因使得2-萘乙醇的产量在外源添加1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到0.258 mmol/L，转化率达到野生型的2.3倍。【结论】 在酿酒酵母中实现了2-萘乙醇的生物合成，探索出ARO9和ARO10是利于2-萘乙醇生物合成的基因组合，为工业生产2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法。

一种谷氨酸棒杆菌4-异丙基苯甲酸诱导型启动子的设计与应用

毋舒宁, 苏永平, 李冬雪, 柏映国, 刘波, 张志伟

2024, 40(7): 108-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0174

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【目的】 谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物，挖掘可调控性元件可有效拓展谷氨酸棒杆菌研究和应用的广度和深度。【方法】 在谷氨酸棒杆菌组成型强启动子P_H10上嵌入阻遏蛋白CymR结合的操纵序列CuO，构建了4-异丙基苯甲酸（Cumate）为诱导剂的启动子P_H10-CuO。【结果】 绿色荧光蛋白作为报告基因的实验结果显示，无诱导剂时，谷氨酸棒杆菌工程菌相对荧光强度较低；以25 μg/mL 4-异丙基苯甲酸诱导12 h时，谷氨酸棒杆菌工程菌荧光强度达62 000，证明P_H10-CuO具有很好的严谨性和诱导表达强度。构建了以启动子P_H10-CuO调控recET和Cas12a表达的谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒，实现谷氨酸棒杆菌染色体上靶标基因的精准编辑和外源基因插入。【结论】 诱导型启动子P_H10-CuO具有表达强度高且渗漏表达低的特点，可用于谷氨酸棒杆菌中被其调控基因的时序性表达。

鸡毒支原体和滑液囊支原体双重LFD-RPA快速检测方法的建立

田兴苗, 王健霖, 郭磊, 司朵朵, 龚振兴, 李继东

2024, 40(7): 117-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1107

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【目的】 鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）和滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae, MS）是对家禽危害最大的两种支原体，MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）和测流层析试纸条（lateral flow dipstick, LFD）相结合，建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】 基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针，优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法，评价其灵敏度、特异性、稳定性，同时对120份临床样品进行检测。【结果】 双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10 min即可完成扩增，其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测，二者符合率为93.3%。【结论】 MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增，其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好，无需使用任何仪器即可观察到结果，适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

水稻黄化早抽穗突变体 hz1 的基因鉴定及功能分析

庞梦真, 徐汉琴, 刘海燕, 宋娟, 王佳涵, 孙丽娜, 姬佩梅, 尹泽芝, 胡又川, 赵晓萌, 梁闪闪, 张泗举, 栾维江

2024, 40(7): 125-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0132

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【目的】 水稻的抽穗期对水稻地域适应性及水稻产量至关重要，对水稻抽穗期基因进行鉴定及功能分析，可以为水稻育种提供优异的基因资源。【方法】 通过BSA-seq方法对一个黄化早抽穗突变体hz1（huangzao 1）进行基因定位克隆及连锁分析；利用RT-qPCR技术分析目的基因HZ1的表达谱，并用水稻原生质体瞬时转化查明HZ1的亚细胞定位；对突变体的抽穗期、叶绿素含量、过氧化氢含量等生理指标进行测定，详细分析其表型变化。【结果】 田间表型观察发现hz1表现早抽穗，长日照（long-day, LD）及短日照（short-day, SD）条件下hz1的抽穗期相同，分别比野生型（wild type, WT）早抽穗43 d和26 d，表明hz1是一个光周期不敏感的突变体。同时hz1表现黄化表型，相比WT，叶绿素含量下降。遗传分析表明hz1由隐性单基因控制，F₂混池高通量测序将目的基因定位于水稻第6染色体上17.8 Mb区间内，分析发现该区间内一个T-DNA插入位点LOC_Os06g40080与hz1目标性状完全连锁，LOC_Os06g40080为已知的SE5基因，编码血红素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO1）。HZ1/SE5在叶片中高表达，在LD及SD条件下具有昼夜节律性表达。亚细胞定位发现HZ1/SE5蛋白定位于叶绿体中。表达调控分析表明HZ1/SE5主要通过调控水稻成花素Hd3a和RFT1的表达来调控水稻的抽穗期；并通过调控叶绿素合成途径相关基因的表达水平影响水稻叶绿素水平变化。【结论】 黄化早抽穗突变体hz1由于血红素加氧酶编码基因SE5突变导致其对光周期不敏感，HZ1/SE5基因通过调控水稻成花素基因及叶绿素合成途径相关基因的表达而影响水稻的抽穗期及叶片的黄化。

大豆细胞质雄性不育系及其恢复系的比较转录组分析

高萌萌, 赵天宇, 焦馨悦, 林春晶, 关哲允, 丁孝羊, 孙妍妍, 张春宝

2024, 40(7): 137-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0219

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【目的】 “三系”法是选育杂交大豆的主要途径，但恢复系中仅有少数大豆恢复基因被克隆，为挖掘更多新恢复基因，从而促进多基因聚合的强恢复系选育，提高杂种F₁的育性稳定性。【方法】 以大豆细胞质雄性不育系JLCMS5A和其恢复系JLR2为材料，采用转录组测序技术分析JLCMS5A和JLR2花蕾不同时期的转录水平变化，挖掘调控育性恢复和花蕾发育进程的相关基因和通路。进一步对具有恢复基因特征编码PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行基因注释、序列差异分析、RT-qPCR验证、系统进化分析及蛋白结构预测，挖掘育性恢复相关基因。【结果】 转录组测序鉴定到17 181个DEGs，其中有3 856个DEGs与发育时期相关，2 808个DEGs与育性相关。GO（gene ontology）功能注释表明，与育性相关的DEGs主要富集在ADP结合、核酸结合转录因子活性和蛋白激酶活性等功能类别，与发育时期相关的DEGs主要富集在蛋白质异源二聚化活性、DNA复制和DNA结合等功能类别。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析表明，育性相关DEGs主要参与内质网蛋白质加工、葡萄糖苷酸生物合成和植物激素信号转导等与蛋白质、糖类和信号转导密切相关的代谢通路，发育时期相关DEGs主要参与DNA复制、错配修复、淀粉和蔗糖代谢等与细胞分裂和能量物质降解密切相关的代谢通路。育性恢复候选基因分析发现，JLR2中的Glyma.09G176400可能在调控大豆细胞质雄性不育育性恢复过程中起到一定作用。【结论】 共鉴定到3 856个与发育时期相关的DEGs，2 808个与育性相关的DEGs；鉴定出具有恢复基因特征编码PPR蛋白的DEGs 15个；挖掘了1个育性恢复相关基因Glyma.09G176400。

番茄FAD基因家族的鉴定与表达分析

张明亚, 庞胜群, 刘玉东, 苏永峰, 牛博文, 韩琼琼

2024, 40(7): 150-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1090

摘要 ( 359 )

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【目的】 脂肪酸脱氢酶（fatty acid desaturase，FAD）是一类催化植物不饱和脂肪酸合成的关键酶，在植物生长发育及逆境胁迫响应中起重要作用。鉴定番茄SlFAD基因家族，为番茄SlFAD基因家族功能研究及遗传改良提供理论依据。【方法】 采用生物信息学方法，对其基因家族成员进行鉴定，并对其理化性质、基因结构、系统发育树和表达模式等方面进行研究。【结果】 在番茄基因组中共鉴定出26个SlFAD基因，可分为4个亚族；理化性质分析显示SlFAD蛋白的氨基酸个数在119-912个之间，分子量介于13 288.27-102 522.25 Da，SlFAD蛋白在番茄中主要以碱性蛋白的性质存在，大部分SlFAD家族成员为稳定蛋白和亲水性蛋白；亚细胞定位预测SlFAD基因家族成员主要存在于内质网；基因特征分析显示同一亚族间的成员具有较为相似的基因结构和保守基序；启动子顺式作用元件分析显示数量最多的是光响应与激素响应相关的元件；染色体定位显示26个SlFAD家族成员共分布在10条染色体上，6号和12号染色体上成员最多；二级结构预测显示26个SlFADs家族成员均以α-螺旋和β-转角为主；转录组数据及RT-qPCR分析表明SlFAD1、SlFAD4和SlFAD18基因在成熟花药中高度表达，SlFAD23在根尖中高度表达，说明SlFAD1、SlFAD4和SlFAD18可能参与花药发育，SlFAD23可能参与根尖发育；低温胁迫下，SlFAD6和SlFAD21表达量被抑制，说明SlFAD6和SlFAD21可能与低温响应有关系，SlFAD1和SlFAD14在低温胁迫初期显著上调，随后又被抑制，说明该基因在低温胁迫初期发挥重要作用。【结论】 SlFAD基因家族在番茄根尖、叶片、花药的生长发育过程及低温胁迫中发挥重要作用。

甜瓜BZR转录因子家族基因的全基因组鉴定及表达模式分析

臧文蕊, 马明, 砗根, 哈斯阿古拉

2024, 40(7): 163-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0162

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【目的】 油菜素唑抗性因子（brassinazole-resistant，BZR）是植物特有的转录因子，对植物的生长发育起着至关重要的作用。从甜瓜全基因组范围内鉴定CmBZR基因家族成员，分析其相关基因的表达模式，为进一步探究甜瓜BZR基因家族的生物学功能提供基础。【方法】 基于甜瓜全基因组数据，通过BLAST对甜瓜BZR家族基因进行鉴定，利用生物信息学的方法分析了该家族蛋白的理化性质、基因染色体分布、基因结构、蛋白质结构域、系统进化以及启动子顺式作用元件，并利用荧光定量PCR验证BZR家族基因在甜瓜不同组织及不同生长发育时期果实中的表达情况。【结果】 甜瓜中共鉴定到6个BZR基因，系统进化分析可将其分为5个亚家族，CmBZR基因分布于第3、7、8、11和12染色体上。所有的BZR蛋白质都具有保守的结构域。CmBZR基因启动子区域显著富集与生长发育、激素信号转导和非生物逆境胁迫相关的顺式作用元件。CmBEH1-4在茎、两性花以及子房中高表达，在生长期、成熟期、呼吸跃变期和呼吸跃变后期果实中也均有表达。【结论】 在全基因组范围内从甜瓜中系统鉴定出6个甜瓜CmBZR基因家族成员，不同基因在甜瓜的各个组织和不同的生长发育时期均有表达，且表达模式存在差异。

藜麦FLS基因家族的鉴定、表达及DNA变异分析

孙慧琼, 张春来, 王锡亮, 徐宏申, 窦苗苗, 杨博慧, 柴文婷, 赵珊珊, 姜晓东

2024, 40(7): 172-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0094

摘要 ( 245 )

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【目的】 黄酮醇合成酶（FLS）是石竹目植物中多酚类次生代谢的关键酶，为探究FLS基因在藜麦生长发育中的功能，对FLS基因家族进行鉴定和表达分析。【方法】 利用生物信息学分析网站，鉴定出CqFLS家族成员，分析其基因结构、蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、启动子顺式元件以及系统进化关系等，并通过基因克隆、构建表达载体的方法分析其蛋白表达情况。【结果】 共鉴定出3个CqFLSs基因，不均匀分布在2条染色体上，CqFLSs启动子区域包含水杨酸、脱落酸、茉莉酸甲酯和干旱诱导等元件；CqFLS2.1g发现多处InDel和SNP变异，在ch01 28871893、28871125、28872881处编码核苷酸删除，且均注释为上游效应，未检测到移码突变；FLS家族系统进化树分析可知，与其他两个基因相比，CqFLS2.1g与CqFLS1.1g、CqFLS3.10g处于不同分支，表达水平也存在差异，CqFLS2.1g可能发生分化；同时，基因表达分析表明，3个CqFLSs基因在青白1号籽粒中整体表达量高于青黑1号和贡扎4号。对克隆出的CqFLS1.1g用0.3 mmol/L的IPTG诱导，在20℃和37℃的条件下均可成功表达。【结论】 CqFLS1.1g 在花的形成以及籽粒发育过程中发挥作用，而CqFLS2.1g则主要参与藜麦籽粒的形成，CqFLS的表达具有组织特异性，在藜麦生长发育过程中发挥重要的作用。

纳米硒（SeNPs）缓解烟草幼苗铅胁迫和促生效应

杜仲阳, 杨泽, 梁梦静, 刘义珍, 崔红利, 史达明, 薛金爱, 孙岩, 张春辉, 季春丽, 李润植

2024, 40(7): 183-196. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0078

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【目的】 旨在探究纳米硒（SeNPs）对铅（Pb）胁迫烟草幼苗的生长、抗逆性、铅吸收和转运的影响，以揭示SeNPs的促生效应、富硒和阻滞铅吸收及转运的机制。【方法】 以普通烟草（Nicotiana tabacum）为研究对象，通过盆栽实验设置不同处理，包括低剂量（100 mg/L）和高剂量（200 mg/L）Pb胁迫，无机硒（Na₂SeO₃）、SeNPs处理和空白对照组。测定各处理组烟草幼苗的生物量、光合生理参数、抗氧化酶活性、脂质过氧化产物含量以及相关基因表达水平，分析铅和硒在植物体内的含量和分布。【结果】 与对照组相比，硒处理显著促进了烟草幼苗的生长和光合作用，SeNPs促生效应更显著。硒处理还增强了烟草幼苗的抗氧化酶（SOD、POD和APX等）活性和抗氧化物质（抗坏血酸和谷胱甘肽等）的含量，降低了脂质过氧化产物（H₂O₂和MDA）的积累。在铅胁迫条件下，硒处理可显著提高烟草幼苗中硒的含量，同时降低铅的吸收和转运率。【结论】 纳米硒能显著提高植物生物量，保护光合系统，激活抗氧化系统，阻滞铅吸收和转运，促进植物硒富集和改善植物对铅胁迫的抗性。

无患子雄性不育品种‘琦蕊’不同发育时期雄花转录组分析

廖杨梅, 赵国春, 翁学煌, 贾黎明, 陈仲

2024, 40(7): 197-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0039

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【目的】 探究无患子（Sapindus mukorossi Gaertn.）雄性不育品种‘琦蕊’雄花不同发育时期的细胞学特征及差异表达基因，为深入解析无患子雄性不育发生的分子机制提供理论依据。【方法】 在观察雄花花药不同发育过程的细胞学特点基础上，进一步利用RNA-Seq技术分别对小孢子母细胞时期（T1）、四分体时期（T2）、单核小孢子时期（T3）的雄花进行转录组比较分析，筛选关键差异表达基因。【结果】 ‘琦蕊’绒毡层和内层细胞的持续膨大与增殖使得药室结构混乱，药室空间不足，最终导致无可育花粉产生。内源激素测定发现，茉莉酸水平在‘琦蕊’雄花发育过程中呈下降趋势。3个时期的转录组分析共筛选到2 990个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中T2_vs_T1中722个（516个上调，206个下调），T3_vs_T2中1 741个（765个上调，976个下调）。GO和KEGG分析表明，这些DEGs主要富集在代谢过程、细胞分裂、花粉壁合成、激素信号转导等方面，共鉴定到32个花粉发育相关DEGs、27个激素合成及信号转导DEGs。随机选取9个DEGs进行RT-qPCR分析，结果与RNA-Seq数据趋势一致，证明转录组数据的准确性。【结论】 绒毡层细胞持续增殖和内层细胞延迟退化不断挤压小孢子是导致无患子‘琦蕊’雄性不育发生的主要原因，物质代谢、细胞分裂、激素水平、花粉发育等相关基因在雄性不育发生过程中发挥重要作用。

新麦草异戊烯基转移酶PjIPT基因的功能验证

任晓敏, 云岚, 艾芊, 赵乔

2024, 40(7): 207-215. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0152

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【目的】 异戊烯基转移酶（isopentenyl transferases, IPT）参与反式玉米素（trans-zeatin, tZ）的生物合成。tZ是调节植物生长发育和抵抗逆境胁迫的一种细胞分裂素类型，在促进芽生长和调控植物侧枝发育方面具有重要作用。探索IPT的功能，为后续新麦草产量性状改良提供了理论依据。【方法】 通过对新麦草IPT进行系统发育和多序列比对，探究其编码氨基酸序列的特征和同源性。通过花粉管通道法获得过表达PjIPT拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株，并运用逆转录PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot, WB）对转基因植株进行验证，利用实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）对其组织表达模式进行分析，使用液质联用系统测定反式玉米素。【结果】 IPT在新麦草（Psathyrostachys juncea）和二粒小麦（Triticum dicoccoides）等麦类作物中具有高度同源性，且AtIPT9是PjIPT的同源蛋白。通过花粉管通道法获得过表达PjIPT拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株，证明PjIPT上调植株分枝数。RT-PCR和蛋白质印迹分析显示，PjIPT在转录水平和蛋白水平均能够正常表达。利用不同部位组织RT-qPCR分析PjIPT的空间特异性表达，结果显示，PjIPT在拟南芥的分蘖节和叶中特异性表达。此外，反式玉米素的定量分析表明PjIPT通过参与tZ的生物合成去调控拟南芥植株分枝数。【结论】 PjIPT是上调植株分枝数的关键基因。

大豆镰刀菌根腐病拮抗菌的筛选及生防效果

王芳, 于璐, 齐泽铮, 周长军, 于吉东

2024, 40(7): 216-225. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0070

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【目的】 镰刀菌根腐病是世界范围内大豆生产上最具破坏性的土传病害之一，为获得对禾谷镰刀菌Fusarium graminearum具有较好拮抗效果的生防菌株。【方法】 从健康大豆根际土壤分离细菌，平板对峙法筛选拮抗菌株，通过形态观察、生理生化特性、胞外酶活性及促生特性对菌株进行鉴定分析，采用盆栽试验进一步测定菌株生防及促生效果。【结果】 筛选出的4株芽孢杆菌和1株假单胞杆菌对F. graminearum的抑菌率均达到60%以上，对F. oxysporum，F. solani，F. longifundum以及 F. equiseti也均有一定的抑制作用，其发酵液及挥发代谢物均会影响F. graminearum的生长。5株拮抗菌具有产蛋白酶、纤维素酶以及葡聚糖酶的活性，解磷、解钾、固氮以及产铁载体的能力。综合以上测试结果，菌株20-8具有较强的抑菌及大豆促生效果。根据形态特征及16S rRNA序列分析，将菌株20-8鉴定为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。该菌株的发酵上清液可以破坏F. graminearum菌丝体结构，无细胞发酵上清液可以显著抑制孢子萌发。室内盆栽防效测定结果表明，20-8的稀释发酵液对F. graminearum引起大豆根腐病的防效可达46.08%，并且促进大豆植株生长。【结论】 筛选鉴定的暹罗芽孢杆菌20-8具有解磷、解钾、固氮以及产铁载体及多种胞外酶功能，其稀释发酵液具有较强的抗真菌活性及大豆促生能力，菌株20-8可以用于防治F. graminearum引起的大豆根腐病。

枯草芽孢杆菌B579对黄瓜枯萎病的防治及其诱导抗性研究

范宗强, 冯靖涵, 郑丽雪, 王硕, 彭向前, 陈芳

2024, 40(7): 226-234. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0160

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【目的】 探究枯草芽孢杆菌B579对黄瓜枯萎病菌的生防效果及诱导抗性机理。【方法】 采用平板对峙试验和温室盆栽试验，检测病原菌生长及形态变化、植物生长量、叶片防御酶活性、丙二醛含量、防御相关基因表达量等指标。【结果】 枯草芽孢杆菌B579对黄瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用，抑菌圈周围菌丝出现粗细不均、膨胀、断裂等现象。盆栽试验表明B579对黄瓜枯萎病的防治效果为78.80％。B579处理组黄瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重分别比对照组增加了13.87％、4.17％、15.15％、12.77％。相比单独接种病原菌（FOC）处理，接种 B579 再接种病原菌（B579+FOC）处理在第4天和第7天显著提高了黄瓜叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，并减少黄瓜叶片丙二醛（MDA）的含量（P<0.05）。实时荧光定量PCR 检测结果表明，接种 B579 再接种病原菌后，黄瓜叶片防御相关基因LOX、PR1、PR3和CAT表达量在第4天和第7天显著高于其他处理（P<0.05）。【结论】 枯草芽孢杆菌B579能够通过直接抑制病原菌生长和使黄瓜产生诱导抗性来有效防治黄瓜枯萎病。

黄栌枯萎病拮抗细菌CCBC3-3-1的全基因组测序及比较基因组分析

周江鸿, 夏菲, 仲丽, 仇兰芬, 李广, 刘倩, 张国锋, 邵金丽, 李娜, 车少臣

2024, 40(7): 235-246. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0158

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【目的】 从黄栌枝干内部分离到的细菌CCBC3-3-1菌株对黄栌枯萎病菌（Verticillium dahliae）表现出较强的拮抗作用，从基因组层面深入研究其拮抗机理，为进一步研发生防菌剂提供理论依据。【方法】 利用PacBio RS测序平台完成CCBC3-3-1的全基因组测序，根据16S rDNA序列信息构建系统发育树，并与同属近缘种菌株进行比较基因组学分析；对其发酵液进行LC-MS非靶标代谢组检测。【结果】 CCBC3-3-1基因组总长度为5.16 Mb，由1条环状双链染色体和3个环状质粒组成，GC含量48.08%，含有5 013个编码基因。经过antiSMASH预测，CCBC3-3-1基因组中有8个抗生素及次生代谢物合成相关的基因簇，其中2个与已知基因簇相似度较低，5个基因簇功能未知，其发酵液中检测出6种已知抗生素类物质。比较基因组学分析结果表明CCBC3-3-1基因组与泛菌属内4个近缘种均有显著差异，而且CCBC3-3-1在16S rDNA系统发育树上形成一个相对独立的分支。【结论】 CCBC3-3-1是泛菌属的一个新变异种Pantoea sp.，能够产生多种抗生素类物质，在黄栌枯萎病生物防治方面具有重要应用潜力。

不同覆盖处理对菠萝园土壤代谢物和细菌群落结构的影响

刘传和, 贺涵, 邵雪花, 何秀古

2024, 40(7): 247-258. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1183

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【目的】 探测不同覆盖处理对菠萝园土壤微生态环境的影响。【方法】 以未覆盖为对照（CK），比较研究了聚乙烯地膜（PM）、无纺布（NW）和可降解地膜（BF）覆盖下菠萝营养生长期土壤理化性状、酶活性以及细菌群落结构、代谢物的差异。【结果】 与CK相比，NW土壤中有效磷以及BF土壤中全氮含量显著提高；3种覆盖下土壤的过氧化氢酶和蔗糖酶活性显著降低，但PM土壤的蛋白酶、BF的酸性磷酸酶活性显著提高。与CK相比，PM土壤的放线菌数量减少；NW的细菌数量增多，放线菌减少；BF土壤的真菌和细菌数量增多，放线菌减少。16S测序表明3种覆盖的细菌菌群多样性均低于CK，其中BF的菌群丰度相对最高。与CK相比，PM、NW、BF土壤共筛选到17种显著差异代谢物，主要包括糖类、有机酸、含氮化合物和醇类代谢物，3种覆盖处理中BF土壤的糖类代谢物积累最高。CCA分析表明，pH影响土壤菌群结构发生分异，土壤养分、酶活性与细菌群落结构存在正相关。【结论】 3种覆盖处理中NW有利于维持营养生长期菠萝园土壤相对稳定的微生态环境。

金耳和毛韧革菌麦角硫因生物合成基因的克隆及生物信息学分析

沈真辉, 曹瑶, 杨林雷, 罗祥英, 子灵山, 陆青青, 李荣春

2024, 40(7): 259-272. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0116

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【目的】 探究金耳和毛韧革菌麦角硫因生物合成途径。【方法】 利用PCR扩增技术分别克隆金耳和毛韧革菌的麦角硫因合成酶基因Egt1和Egt2并利用生物信息学软件分析其功能；高效液相色谱技术鉴定2个物种的组氨酸三甲基内盐中间产物、麦角硫因及其含量。【结果】 成功克隆得到了2个物种Egt1和Egt2基因的完整DNA序列。生物信息学分析表明，2个物种的Egt1均含有EgtD和SAM依赖性甲基转移酶等功能结合域，Egt2均含有磷酸吡哆醛（LPL）和半胱氨酸脱硫酶的结合位点； Egt1和Egt2与裂殖酵母和粗糙脉孢菌等模型真菌具有相似的功能域和底物结合位点，表明Egt1和Egt2可能与这些模式真菌具有相似的基因功能。高效液相色谱法分析表明，金耳芽孢（JEYB）、毛韧革菌发酵液（ShFJY）、菌丝体（ShJST）及金耳子实体（JEZST）中均含有组氨酸三甲基内盐和麦角硫因，并且金耳子实体麦角硫因含量最高（113.19 μg/g），分别是金耳芽孢、毛韧革菌发酵液和毛韧革菌菌丝体的7.45倍、26.14倍和27.74倍。【结论】 首次鉴定了金耳和毛韧革菌的Egt1和Egt2基因。推测金耳和毛韧革菌的生物合成途径都是由组氨酸在Egt1酶催化形成组氨酸三甲基内盐，再由Egt1酶催化形成海西烯半胱氨酸亚砜，最后由Egt2酶催化最终形成麦角硫因。

褐角苔FfCYP98基因克隆及其功能分析

黄丹, 姜山, 彭涛

2024, 40(7): 273-284. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0068

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【目的】 细胞色素P450单氧化酶98（Cytochrome P450 monooxygenase 98, CYP98）是苯丙烷途径中的关键限速酶，拟探究其在角苔植物中是否参与苯丙烷途径中生物合成及抗病功能，为今后研究早期陆生植物的进化和适应逆境胁迫的生理机制提供参考。【方法】 利用RACE技术从褐角苔中克隆 FfCYP98 cDNA全长序列，对其进行生物信息学和亚细胞定位分析，并通过构建过表达载体转化拟南芥突变体 FfCYP98-OE1 进行功能验证。【结果】 FfCYP98 cDNA序列开放阅读框1 305 bp，与苔藓植物芽孢角苔和小立碗藓CYP98在进化关系上最近，亚细胞定位结果显示FfCYP98定位于细胞核和细胞质。过表达FfCYP98基因后发现FfCYP98-OE1植株总酚、总黄酮和苯丙烷合成途径中C4H、4CL和C3H的表达量均显著高于拟南芥WT植株。另外，用灰霉菌侵染褐角苔和拟南芥FfCYP98-OE1植株后发现FfCYP98表达量显著上调，FfCYP98-OE1植株枯死的速度明显比WT植株慢，且拟南芥FfCYP98-OE1植株中总酚、总黄酮和苯丙烷合成途径中C4H、HCT、C3H和CAD四个基因的表达量均显著高于WT植株。【结论】 褐角苔FfCYP98可能通过调控苯丙烷途径合成相关基因的表达，参与了苯丙烷途径中酚类和黄酮类化合物的生物合成，并与植物的抗病性有关。

柴达木盆地昆特依盐湖可培养嗜盐细菌多样性研究

马想蓉, 马欣, 陈胤勋, 龙启福, 王嵘, 邢江娃

2024, 40(7): 285-298. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1219

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【目的】 探究不同富集时间、培养盐度、稀释梯度、培养基等对氯化物型昆特依高盐盐湖可培养嗜盐细菌多样性的影响，确定嗜盐细菌的最佳分离培养条件，挖掘更多的环境嗜盐细菌资源。【方法】 从昆特依盐湖中采集水泥混合样本，选取7种培养基和10%、18% NaCl两个盐度，采用富集培养法、平板稀释涂布法和平板分区划线法分离嗜盐菌；通过16S rRNA基因测序与BLAST序列比对确定菌株系统分类学地位。同时采用免培养Illumina MiSeq高通量测序技术分析昆特依盐湖细菌群落结构多样性特征。【结果】 免培养昆特依盐湖样本中共鉴定到细菌39门64纲101目219科703属，其中假单胞菌门（Pseudomonadota）、厚壁菌门（Bacillota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinomycetota）为主要的优势菌门。根据菌落的大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起状态和边缘特征等，共分离出436株嗜盐菌，隶属于3门3纲6目9科28属77种，其中16株可能为潜在新种。3门为厚壁菌门（Bacillota）、假单胞菌门（Pseudomonadota）和放线菌门（Actinomycetota），且均为免培养测序结果中的优势菌门。在属水平上，芽孢杆菌属（Bacillus）、盐单胞菌属（Halomonas）、喜盐芽孢杆菌属（Halobacillus）、枝芽孢菌属（Virgibacillus）和卤水杆菌属（Salicola）为优势菌属。肿块芽孢杆菌属（Tuberibacillus）、越南蔷薇菌属（Rossellomorea）和谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）是首次从盐湖中分离得到。18% NaCl分离得到的菌株数量明显少于10% NaCl，且多样性较低，芽孢乳杆菌科（Sporolactobacillaceae）是该条件下分出的特有菌科。7种培养基中，1/2 RCA培养基分离效果最好。最佳富集培养时间为0、7和60 d，最佳样品稀释梯度为10^-2和10^-3。【结论】 从昆特依盐湖中共分离出嗜盐细菌3门3纲6目9科28属77种。应用多种培养基，设置不同盐度、富集培养时间和稀释梯度等可显著提升可培养嗜盐菌的多样性。

糖磷酸酶的挖掘及其酶学性质研究

乔烨, 张楠, 杨建花, 张翠英, 朱蕾蕾

2024, 40(7): 299-306. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0095

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【目的】 在以淀粉或糊精为底物合成具有高附加值的单糖的多酶级联反应中，利用糖磷酸酶催化发生不可逆的脱磷反应可以高效拉动整个反应朝产物生成的方向进行。本研究旨在挖掘新的糖磷酸酶并对酶学性质进行鉴定。【方法】 通过基因挖掘的手段筛选得到一种来源于嗜热菌Thermoproteus sp.CIS_19的未知功能的基因TsPase具有糖磷酸酶活性，在E. coli BL21（DE3）中实现异源可溶性表达及纯化，进一步对其酶学性质进行表征。【结果】 最终确定糖磷酸酶TsPase的最适反应温度是70℃，T_m值为（80.3 ± 1.3）℃，最适反应pH为4，金属离子Mg²⁺对TsPase有较强的促进作用。针对底物为塔格糖6磷酸盐的动力学常数K_m为（2.40 ± 0.98）mmol/L，催化常数k_cat为（102.50 ± 8.60）min^-1。将TsPase应用于体外多酶合成体系中，以10 g/L麦芽糊精为底物，一锅法生产D-塔格糖，反应平衡体系中D-塔格糖产量为（4.26 ± 0.03）g/L，转化率可达42.6% ± 0.3%。【结论】 TsPase不仅具有较好的热稳定性和活性，在体外多酶合成体系中也具有优势，这些特征在以后的理论研究及工业生产中具有一定的科学价值。

分子伴侣增强蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及对羊毛鳞片层的作用分析

蔡逸安, 张轶群, 杨子璇, 刘业学, 刘文龙, 路福平, 李玉

2024, 40(7): 307-313. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0136

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【目的】 通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平，并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析，旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础。【方法】 利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达，首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1和Ydj1分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用，并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析。【结果】 TPRK在毕赤酵母GS115中表达，其最适反应条件为65℃、pH 9.0，且具有良好的热稳定性和pH稳定性。过表达ssa1、hac1、erj5和sil1基因的重组菌株酶活分别提升了36.8%、20.0%、17.7%和14.8%。5 L发酵罐进行高密度发酵，诱导72 h后，TPRK的酶活达到77 471.99 U/mL。在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落，起到剥鳞效果，并且最适水解条件为：TPRK添加量为300 U/mL、反应温度55℃、pH 9.0和反应时间2 h。【结论】 过表达分子伴侣Ssa1能够有效提升TPRK的表达量，利用该TPRK处理羊毛纤维，可有效去除羊毛鳞片层，而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小。

小龙虾prx 6基因在对抗金黄色葡萄球菌感染中的分子作用机制研究

金博阳, 秦仕宇, 张明达, 李倩倩, 文静, 沈秀丽, 杜志强

2024, 40(7): 314-322. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-1205

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【目的】 旨在研究prx 6基因在小龙虾先天免疫中的调控作用机制，探索小龙虾prx 6基因在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染后发挥免疫调控作用的可能分子机制。【方法】 选取prx 6基因作为研究对象，提取正常小龙虾各组织的总RNA，利用RT-qPCR分析目的基因在小龙虾各组织中的分布，并检测S. aureus免疫刺激后，prx 6基因在小龙虾相关组织中的表达模式。通过RNA干扰技术（RNAi）敲低prx 6基因表达量，在感染S. aureus后，测定小龙虾肝胰腺中Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9和Pc-lectin 1免疫效应基因的相对表达量。同时，进一步对小龙虾血淋巴中的细菌载量进行统计分析。【结果】 通过对prx 6基因在小龙虾各组织的表达水平分析，观察到该基因在肝胰腺的表达量显著高于其他组织。在S. aureus感染后，小龙虾肝胰腺、血细胞和肠组织中prx 6基因的表达量显著上调，在鳃组织仅有早期表达量有所增加。小龙虾存活率的检测结果表明RNAi下调prx 6基因表达量之后，其生存率显著低于dsGFP+S. aureus对照组。为了进一步探索死亡率升高的原因，研究了抗菌肽基因在抗细菌防御中的表达水平。RNAi实验结果显示，在prx 6基因表达量降低的情况下，小龙虾肝胰腺Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9以及Pc-lectin 1基因表达水平都出现了显著下降。此外，小龙虾血淋巴中的细菌载量检测结果显示，prx 6基因RNAi组的细菌载量显著高于dsGFP+S. aureus对照组。【结论】 小龙虾prx 6基因通过影响抗菌肽基因的表达，以及血淋巴细菌清除能力来参与抗细菌先天免疫应答。

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

田彤彤, 葛家振, 高鹏程, 李学瑞, 宋国栋, 郑福英, 储岳峰

2024, 40(7): 323-334. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0076

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【目的】 全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列，研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】 采用体外培养，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA，进行全基因组测序。【结果】 绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1 060 772 bp，GC含量为29.66％，基因组组分分析后发现，GH3-3株的基因组含有730个编码基因，总长度为914 379 bp，平均长度为1 252.57 bp，占基因组全长的86.2％。串联重复序列共149个，总长为20 926 bp，占基因组全长的1.97％。微卫星DNA序列102个，tRNA 30个，rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中，分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释；在VFDB数据库中，共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站，获得登录号为：PRJNA1051969。【结论】 获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息，预测和注释了其基因的功能，明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

2024, 40(7): 335.

摘要 ( 89 )

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