【目的】探究关键病毒基因和辅助基因对rAAV生产的影响以指导病毒基因表达框的理性设计和工艺优化，实现rAAV生产效率的提升。【方法】首先，明确用于生产rAAV的关键基因元件rep和cap基因的组成和比例，以及辅助病毒基因的关键序列对rAAV生产的影响。然后，据此理性设计质粒上rAAV病毒基因表达框，构建新型三质粒系统。最后，通过对新型三质粒系统关键工艺参数进行优化，建立基于新型三质粒系统的rAAV高效生产工艺。【结果】合理的rep基因和cap基因表达比例对rAAV生产至关重要，辅助病毒基因表达框中仅保留关键蛋白序列E4orf6（adenovirus early region 4 open reading frame 6, E4orf6）和DBP（DNA binding protein, DBP）即可实现同样的rAAV生产效率。据此结果重新设计的新型三质粒系统瞬时转染人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293 cells, HEK293）时，rAAV基因组滴度较传统三质粒系统提高2.6倍。在进一步优化该系统的转染参数后，基因组滴度达到7.8×1011 vg/mL，单细胞产毒量达到1.5×105 vg/cell，相较于优化前分别提高3.7倍和2.4倍。【结论】通过探究rAAV病毒基因和辅助病毒基因的组成与比例对病毒载体包装的影响，重新设计了rAAV的瞬时表达系统，优化并建立了新型三质粒系统的rAAV生产工艺，显著提高了rAAV的产量，其中基因组滴度提高16倍，单细胞产量提高10倍，为rAAV的高效工业化生产奠定了基础。
