非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是指通常不编码蛋白质的功能性RNA分子,多通过调控编码基因的表达和功能发挥重要的生理作用。微小RNA(microRNA, miRNA)、环状RNA(circular RNA, circRNA)及长编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是目前已知的三大类具有重要生理和病理意义的调控型ncRNA,其基因的缺失重排和表达失调与多种疾病的发生发展密切相关。成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白质系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)是一类广泛存在于细菌和古菌中的免疫防御系统,由CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)和引导RNA(guide RNAs, gRNA)共同组成。该系统利用gRNA引导Cas核酸酶剪切和清除外源基因,因此Cas酶对靶DNA/RNA的精准识别和有效切割是由gRNA决定的。CRISPR/Cas技术具有优异的基因组定点编辑和转录本特异性剪切能力,能精准高效地编辑、干预和检测ncRNA的异常,帮助人们成功诊治疾病。本文在总结Cas9和Cas13 gRNA的组成和设计原则的基础上,针对miRNA、circRNA及lncRNA基因和其RNA自身或RNA形成过程中产生的特殊分子特征,重点介绍针对三类ncRNA的gRNA的设计策略和敲除靶点的选择,以及Cas9和Cas13核酸酶如何在gRNA高特异性和高效率的引导下,对异常miRNA、circRNA和lncRNA进行精准检测和干预。进一步讨论3类ncRNA的gRNA设计异同点和CRISRP/Cas应用在ncRNA上所面临的挑战,并对未来精准靶向ncRNA的gRNA设计进行展望,旨在为CRISPR/Cas技术在治疗ncRNA相关疾病上的应用提供参考。